子宫颈细胞学p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测专家共识

中华医学会病理学分会细胞病理学组
Expert Group of Cytopathology of Chinese Society of Pathology
刘东戈（北京医院病理科 国家老年医学中心 中国医学科学院老年医学研究院，北京 100730），Email：13661275182@163.com 金木兰（首都医科大学附属北京朝阳医院病理科，北京 100020），Email：kinmokuran@163.com Liu Dongge (Department of Pathology, Beijing Hospital; National Center of Gerontology; Institute of Geriatric Medicine, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100730, China), Email: 13661275182@163.com Jin Mulan (Department of Pathology, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100020, China), Email: kinmokuran@163.com

执笔人：梅平（南方医科大学附属广东省人民医院 广东省医学科学院病理科，广州 510080）；徐海苗（浙江省肿瘤医院病理科，杭州 310005）；许晶晶（郑州大学第一附属医院病理科，郑州 450052）
一、背景 （一）中国子宫颈癌筛查现状及筛查管理面临的挑战

子宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，2020年全球约60.4万女性被诊断为子宫颈癌，约34.2万女性死于子宫颈癌，中国子宫颈癌新发病例为109 741例，死亡病例为59 060例，分别占全球宫颈癌发病率和病死率的18.2%和17.3%［1, 2］。2020年WHO发布了具有里程碑意义的《加速消除子宫颈癌全球2030战略》，全世界包含中国在内的194个国家首次共同承诺消除子宫颈癌［3］。国务院发布的《中国妇女发展纲要（2021—2030）》［4］中明确了一系列指标，如实现70%的适龄女性宫颈癌筛查，与WHO战略目标高度一致。

高质量的筛查是消除子宫颈癌的关键因素，2022年1月18日，国家卫生健康委员会印发《宫颈癌筛查工作方案》，推荐宫颈细胞学检查、高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）检测为中国宫颈癌的初筛方法。目前我国宫颈癌筛查仍存在一些问题：（1）筛查覆盖率低；（2）有经验的细胞病理医师匮乏，细胞学、组织病理学、阴道镜医师规范化培训有待进一步加强；（3）人乳头瘤病毒（HPV）产品多，质量参差不齐，部分产品检测结果的可靠性欠佳。

中国现行指南［5, 6］就子宫颈癌筛查异常管理提出了较为具体的指引，但如下几种情况如何管理，尚存在一定的不足：HPV初筛阳性的女性、联合筛查结果不一致（细胞学阴性/HPV阳性）的女性、细胞学初筛结果为不能明确意义的非典型鳞状上皮细胞（ASC-US）/低度鳞状上皮内病变（LSIL）的女性、年轻有生育需要而细胞学阳性或HPV阳性却无法行阴道镜检查的女性。是否能借助一些辅助技术弥补上述问题的不足，目前尚无可供借鉴的共识/指南。

 （二）p16和Ki-67生物标志物意义

p16（p16INK4a）：p16基因表达的抑癌蛋白p16在真核细胞周期调节中发挥着抗细胞增殖的效应。在分化成熟的上皮细胞中，p16不能被免疫细胞化学方法检出。HR-HPV持续感染时，HR-HPV E7蛋白介导pRb功能失活，细胞表现出过度增殖，p16为了发挥其抗增殖效应，出现过度表达。此时免疫细胞化学检测出异常增殖细胞中的p16呈强阳性，因此p16的过度表达反应了宫颈细胞的异常增殖［7］。Ki-67：Ki-67与细胞增殖相关，可作为评价细胞生长分数的指标，与多种肿瘤细胞增殖活性有关［8, 9］。

正常生理条件下，p16和Ki-67相互排斥，若同一细胞内二者同时表达，表明细胞周期失调控，细胞异常增殖，因此同一细胞内二者同时表达可作为细胞周期调控失常的一个指标，提示子宫颈上皮高级别病变［10］，是一种不依赖于形态学的客观标志物。

子宫颈p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测作为宫颈细胞学检查和HR-HPV检测两类筛查方法的补充，其中的一些产品获得了国家药品监督管理局和美国食品药品监督管理局的批准。为了规范该检测技术，并为病理科及临床开展该项检测提供指导，中华医学会病理学分会细胞病理学组组织相关专家，根据我国子宫颈癌防治现状，在参考国内外大量文献的基础上制订了专家共识。

 二、p16/Ki-67免疫细胞化学双染制片技术及质量控制

p16/Ki-67免疫细胞化学双染综合了液基薄层细胞制片术和免疫细胞化学染色技术，但并非2种技术的简单叠加，双染在试剂、耗材、操作和判读上均有相应的要求。在开展该项目时，推荐优先选择双染专用试剂盒，同时需对检测技术平台（试剂、耗材、设备）进行适配性验证及技术操作人员和判读医师的培训、考核。

（一）p16/Ki-67免疫细胞化学双染实验操作流程及质控要点

进行双染的标本通常选用液基细胞学样本，需保证细胞形态完整、抗原蛋白得到良好的固定。

1.制片：膜式或沉降式液基薄层细胞制片。

2.免疫细胞化学染色：按照说明书采用全自动免疫组织化学仪或手工操作。

3.质量控制：（1）抗原修复：注意避免抗原修复引起的细胞脱片。（2）质控品：包含阳性质控和阴性质控。①阳性质控：建议使用已知阳性的病例作为质控品。②阴性质控：宫颈细胞学样本中存在已知p16和Ki-67抗原表达阴性的细胞，其可作为内部阴性质控；同时需包含外部阴性对照。

 （二）p16/Ki-67免疫细胞化学双染判读

1.细胞满意度评估：按照宫颈细胞学Bethesda报告系统［11］进行标本满意度评估。（1）若标本评估不满意，且无双染阳性细胞，则视为标本不满足判读条件；（2）无论标本满意/不满意，若存在至少一个双染阳性细胞，则判读为双染阳性。

2.p16/Ki-67免疫细胞化学阳性染色结果的判断标准：不同的产品其显色可能不同，目前常见的产品p16显示为细胞质和/或细胞核棕色，Ki-67显示细胞核红色；或p16显示为细胞质和/或细胞核红色或玫红色，Ki-67显示细胞核棕色。（1）p16/Ki-67免疫细胞化学双染判读不依赖于细胞形态学；（2）细胞质需共同定位于同一个细胞内，且位于同一聚焦平面内（图1，2）。注：如果细胞质和细胞核染色都很深，且由于强烈的棕色染色而难以评估红色染色，增加显微镜光照强度将有助于评估细胞核内是否有红色信号存在。

10.3760/cma.j.cn112151-20240203-00078.F001 p16细胞质/细胞核呈棕色，Ki-67细胞核呈红色 免疫细胞化学 高倍放大 p16显示细胞质/细胞核呈红色/玫红色，Ki-67 细胞核呈棕色 免疫细胞化学 高倍放大 仅有p16细胞质和/或细胞核染色（棕色）的宫颈上皮细胞 免疫细胞化学 高倍放大 仅有Ki-67细胞核染色（红色）的宫颈上皮细胞 免疫细胞化学 高倍放大 细胞簇中Ki-67着色细胞核与p16着色细胞质不在同一聚焦平面，判读结果为阴性 免疫细胞化学 高倍放大 细胞簇中Ki-67染色细胞核嵌入p16染色细胞质中，即在同一聚焦平面，判读结果为阳性 免疫细胞化学 高倍放大

3.p16/Ki-67免疫细胞化学阴性结果的判断标准：（1）仅见呈蓝色的宫颈上皮细胞；（2）仅有p16细胞质和/或细胞核染色（棕色）的宫颈上皮细胞（图3）；（3）仅有Ki-67细胞核染色（红色）的宫颈上皮细胞（图4）。

4.p16/Ki-67双染判读流程：（1）以10×或20×视野观察p16/Ki-67染色玻片；（2）首先寻找单个、散在的双染细胞，阳性判读标准详见上述；（3）评估细胞簇中p16/Ki-67的表达：①在细胞簇边缘寻找单个、散在的双染阳性细胞，a.如为“是”判断为阳性，b.如为“否”进入步骤②；②评估细胞簇的p16染色为局灶性或弥漫性，a.如为局灶性p16染色，判断为阴性，b.如为弥漫性p16染色，进入步骤③；③评估细胞簇中Ki-67着色细胞核与p16着色细胞质是否在同一聚焦平面，a.若不在同一聚焦平面，判读结果为阴性（图5，6），b.Ki-67染色细胞核嵌入p16染色细胞质中，即在同一聚焦平面，判读结果为阳性（图7，8）。

5.非特异性背景染色：二氨基联苯胺（棕色）和/或快红检测化学反应可造成非特异性背景染色，这将为评估及解读带来挑战。若玻片的75%以上存在非特异性染色，则样本不可被评估，应报告为样本不满足判读条件。

 三、p16/Ki-67免疫细胞化学双染的临床应用

1.在细胞学初筛为ASC-US/LSIL中的分流价值：一项对宫颈细胞学筛查结果为LSIL和ASC-US的女性宫颈活检组织学结果显示：2年内仅有29.3%和10.2%的患者有潜在的宫颈上皮内瘤变（CIN）Ⅱ+和CINⅢ的风险［12］。如何对ASC-US/LSIL患者进行管理、提高高级别病变的检出率、减少不必要的宫颈活检/锥切手术，是宫颈病变管理的重要内容。PALMS研究［13］对575例ASC-US和529例LSIL使用双染检测和HPV检测分流进行了比较，以宫颈活检CINⅡ+作为临床终点，结果表明双染对CINⅡ+病变的灵敏度与HPV检测相当或稍低，但特异度更高；另一方面，双染对高级别病变的阳性预测值显著提高，尤其是在LSIL和年龄<30岁的ASC-US女性人群。

2.在HR-HPV初筛阳性中的分流价值：目前HR-HPV DNA检测被推荐用于子宫颈癌初筛［14, 15］，国内外临床研究显示双染在HPV初筛阳性人群具有有效的分流及风险分层作用，并且在灵敏度和特异度之间有更好的平衡。美国一项多中心前瞻性临床试验IMPACT研究显示［16］：双染对初筛HPV阳性女性进行分流，无论是否进行HPV 16/18基因分型，其识别宫颈高级别病变的灵敏度均优于细胞学。此外，无论是否进行HPV 16/18基因分型，双染分流策略比基于细胞学检测的分流策略能做到更好的风险分层，初筛HPV阳性双染阴性的女性宫颈高级别病变1年累积风险显著低于基于细胞学的分流策略。一项美国北加州凯撒医疗机构（Kaiser Permanente Northern California，KPNC）的前瞻性研究［17］评估了HPV筛查阳性的女性，对基于细胞学检测和基于双染检测的分流策略进行了比较。结果表明：与细胞学检测相比，双染阳性比细胞学阳性具有更高的CINⅢ+风险。另外，该研究还显示HPV16/18阴性且双染阴性的女性CINⅢ+的风险极低，甚至可将复查间隔安全地延长至3年。与细胞学检测分流策略相比，双染分流策略每检出1例CINⅢ+所需的阴道镜检查次数减少了32.1%。KPNC的另一项前瞻性队列研究［18］结果显示：与细胞学检测异常（≥ASC-US）相比，双染阳性CINⅡ+5年累积风险显著升高（25.0%比31.0%）。与细胞学阴性结果相比，双染阴性CINⅡ+5年累积风险显著降低（12.3%比8.5%）。在双染阴性的女性中，CINⅡ+和CINⅢ+5年内的风险均低于阴道镜转诊阈值。HPV阳性双染阴性的女性宫颈癌前病变3年累积风险与HPV阳性细胞学阴性的女性间隔1年宫颈癌前病变的风险接近，因此对于HPV阳性双染阴性的女性复查间隔可以安全地延长到3年。

3.在宫颈细胞学与HR-HPV联合筛查中的分流价值：荷兰一项基于人群的子宫颈癌联合筛查队列研究（VUSA-Screen）纳入了约2.5万名30~60岁女性［19］，对1 021名HPV阳性且细胞学阴性的女性采用双染进行分流，并与HPV 16/18分型检测的分流方案进行对比，比较了两种分流方案对HPV阳性且细胞学阴性的人群CINⅡ+及CINⅢ+的检出率及5年累积发生率，结果显示：以组织学结果CINⅡ+或CINⅢ+为终点，双染均显示更高的灵敏度（68.8%比43.8%；73.3%比46.7%），其特异度稍低（72.8%比79.4%；70.0%比78.3%）。HPV阳性、细胞学阴性人群的CINⅡ+及CINⅢ+的5年累积率分别为12.2%及6.9%。若将人群进一步分流，双染阴性人群CINⅡ+5年累积率比HPV 16/18阴性人群的CINⅡ+5年累积率明显降低（5.4%比8.5%）。研究结果表明双染可以作为联合筛查HPV阳性且细胞学阴性人群的分流策略（图9）。

10.3760/cma.j.cn112151-20240203-00078.F002 p16/Ki67免疫细胞化学双染在细胞学初筛、人乳头瘤病毒初筛或联合筛查后的异常管理中的应用

4.在宫颈病变治疗后监测复发中的价值：治疗后的宫颈高级别病变女性有CINⅡ+复发的风险，目前用细胞学或细胞学、HR-HPV联合检测进行治疗后监测，但特异度有限。SIMONATH研究［20］对323例宫颈高级别病变女性治疗后12个月的细胞学、HR-HPV以及DNA甲基化检测监测复发进行了比较，并以治疗后6个月和/或12个月的阴道镜检查及宫颈活检确定的组织学结果为终点，对活检时或活检前获得的剩余液基细胞学样本进行p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测，研究表明双染和HR-HPV联合检测的灵敏度与细胞学/HR-HPV联合检测相似（87.2%比89.7%），但特异度显著提高（74.2%比58.1%），阳性预测值亦显著提高（33.7%比24.3%），而阴道镜转诊率显著降低（33.8%比48.2%）。

5.在其他临床场景中的价值：双染对绝经后妇女的宫颈病变、放化疗治疗后患者的随访、不除外高级别病变的非典型鳞状上皮细胞、宫颈腺上皮病变与良性腺上皮的鉴别诊断均有辅助诊断作用。

 四、p16/Ki-67免疫细胞化学双染应用中存在的问题及对策

1.检测技术：不同实验室或操作人员之间因实验方法、检测用试剂和操作流程的差异，可能会出现染色不一致的情况，包括染色的均匀性、染色强度、背景染色等；因细胞学标本无法复制一张“同样的涂片”，即便使用同一份标本进行HPV、细胞学以及p16/Ki-67双染检测，也无法复制同样的成分。因此需建立标准的双染技术操作流程，实行严格的质量控制，确保结果的可重复性［21］。

2.判读：双染结果由细胞病理医师判读，判读结果可能存在个体差异。需要建立明确的判读标准，对判读人员进行规范培训，以提高判读的准确性和不同判读者之间的一致性［22］，并定期进行质控。

 五、p16/Ki-67免疫细胞化学双染人工智能辅助判读的可行性探讨

双染判读较之子宫颈细胞学形态判读简单、明确，但对细胞簇的判读还有一定的困难，并且工作量大时需要耗费一定的人力。近年来，人工智能逐步参与到子宫颈癌筛查的多个环节，人工智能辅助细胞学诊断显著提高了工作效率［23, 24］。相信细胞学医师与人工智能专家的合作也能研发出可以辅助双染判读的人工智能产品，提高判读效率和质量。

 六、总结

本共识旨在为p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测提出指导性意见，期望对各级医疗机构和医师提供参考和帮助，在临床实践中还需结合患者的情况综合考虑，避免漏诊和过度治疗，达到规范化诊疗的目的。

《子宫颈细胞学p16/Ki-67免疫细胞化学双染检测专家共识》编写和讨论专家组成员（按单位名称汉语拼音字母顺序排序）：安徽医科大学第一附属医院北区/安徽省公共卫生临床中心（杨苗苗）；北京大学医学部/北京大学第三医院（朱翔）；北京医院/国家老年医学中心/中国医学科学院老年医学研究院（崔娣、何淑蓉、刘东戈）；成都市妇女儿童中心医院（华平）；重庆大学附属肿瘤医院（肖觉）；福建医科大学病理诊断中心（王斌）；福建省妇幼保健院 福建医科大学妇儿临床医学院（许淑霞）；复旦大学附属肿瘤医院（陈颖、平波）；广东省妇幼保健院（秦艳）；哈尔滨医科大学附属第一医院（吴鹤）；河北省肿瘤医院（杜芸）；河南省人民医院/郑州大学人民医院（胡爱侠）；湖北省妇幼保健院/湖北省妇女儿童医院/湖北省生殖保健中心（胡俊波）；吉林大学第一医院乐群院区（倪劲松）；解放军总医院第一医学中心（李杰）；江苏省人民医院/南京医科大学第一附属医院/江苏省妇幼保健院（戎荣）；空军军医大学第一附属医院（付欣）；空军特色医学中心（任力）；南昌大学第一附属医院（梅金红）；南方医科大学附属广东省人民医院（梅平）；青海大学附属医院（张易青）；山西白求恩医院（刘玲玲）；上海市第一妇婴保健院（朱慧庭）；首都医科大学附属北京朝阳医院（金木兰、梁小龙）；四川大学华西医院（苏学英）；苏州大学附属第一医院（顾冬梅）；天津市中心妇产科医院（陈凌）；潍坊市人民医院（张云香）；温州医科大学附属第一医院（何秋香）；新疆军区总医院（王玉兰）；徐州市中医院（王旭波）；扬州大学附属医院（丁永玲）；浙江省人民医院/浙江省立医院（茹国庆）；浙江省肿瘤医院（徐海苗）；郑州大学第一附属医院（许晶晶）；中国医科大学附属第一医院（吴广平、王健）；中国医科大学附属盛京医院（吕庆杰）；中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院（孟芝兰）；中国医学科学院肿瘤医院（张智慧）；中南大学湘雅二医院（蒋谊）；中山大学附属第一医院（余俐）；中山大学肿瘤防治中心（何洁华）
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