细胞培养液是体外培养细胞提取EV的主要样本来源，适用于各种细胞类型^［2］。这包括来自多细胞和单细胞生物的真核细胞，以及广泛的原核细胞，如革兰阳性和阴性细菌^{［3, 4］}。细胞培养条件能直接或间接影响EV的产量、组成和功能^［5］。因此在真核细胞和原核细胞的培养过程中，尽量详细记录细胞培养的具体参数包括细胞系（如名称、传代数、接种量和提取EV时的细胞密度）、培养基成分（包括基础培养基、各种添加剂如血清、营养素、抗生素或抗真菌药物，以及其他可能的添加剂）和培养条件（如培养模式、温度和pH值）^{［5, 6］}。值得注意的是，一些特定培养基，如胎牛或小牛血清，可能本身就含有EV，这些EV可以被培养中的细胞吸收，并被重新包装成新的EV。商用的无EV培养基需经过严格验证以确保其不含EV^［7］。使用这些特制的无EV培养基和血清培养基可能会改变细胞产生EV的特性。此外，培养物中活细胞与垂死细胞的比例也是一个关键因素，因为它们可能释放不同亚型的EV，且少数垂死细胞产生的EV数量可能超过健康细胞，这一比例会影响EV亚型和数量的分布^［8］。最后，微生物及其组份可能影响宿主细胞产生EV的多种特性，它们可被重新包装进培养物细胞的EV中，同时部分微生物也可释放EV^［9］。

建议1 细胞系培养条件对于提取EV的含量与分布具有重要影响，应详细记录相关培养条件，并对提取后的EV进行对应评估。对于向厂家购买的无EV培养基，应提供培养基处理方法以供评估（强推荐）。

1.血液：血液是人体体液样本中使用最多的样本类型。由于血液采集方便，且其中稳定存在的EV可反映机体的健康和疾病状态，因此血液样本中EV成为理想的液体活检标志物，受到本领域研究者的广泛关注^［10］。但血液中富含脂蛋白、红细胞碎片、非囊泡核酸以及其他与EV大小相似的生物颗粒，这使得血液源性EV的精准分析受到极大挑战。因此，血液EV分离和检测前，应参考国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）相关立场性文件和指南对血液样本进行严格的质量控制：（1）为了提高血液样本质量，最好在患者过夜禁食后进行采血；（2）采用含有柠檬酸钠或乙二胺四乙酸的采血管有助于抑制血小板释放EV，从而保证血液样本EV分析的准确性；（3）样本收集与第一次离心之间的时间间隔应尽量缩短并保持一致，推荐在20 ℃条件下2 500×g离心15 min，收集细胞层上方0.5 cm以上的血浆层，同样条件第2次离心，以减少血小板和白细胞污染的风险，收集去血小板血浆，可新鲜使用，或在液氮中快速冷冻并在-80 ℃条件下长期保持；（4）冻融次数，解冻温度和解冻时间应该有严格要求，推荐37 ℃快速解冻，并尽量避免反复冻融；（5）通过标准化的血液采集和处理最大限度地减少溶血，应监测溶血情况，并报告红细胞计数和血红蛋白浓度的检测数据和仪器参数；（6）在条件允许情况下，应对血小板EV标志物（如CD61或CD41）进行流式检测^{［2，11, 12, 13, 14, 15］}。

2.尿液：尿液EV分离和检测研究中，需要关注样本采集方式、保存条件及采集量^［16］。根据ISEV相关立场性文件和指南针对不同的研究方向和目的，尿液样本的采样方式会有不同，可以选择晨尿或随机尿^{［2，12，16］}。24 h尿液样本收集有助于对尿液EV的准确定量，减少昼夜波动带来的误差。此外，也可根据疾病或检测标志物的不同，收集“首段尿”或“中段尿”。晨尿通常比随机尿更浓缩，可能导致晨尿中EV浓度更高。在许多前列腺癌的研究中，泌尿科医生在直肠指检后收集尿液样本或采集晨尿的首段尿，有望富集前列腺来源EV。定时收集将有助于评估尿液在膀胱中的过渡时间，对于膀胱及其他疾病的研究可能带来附加益处。

尿液样本采集后应在0~4 ℃条件下保存，并在8 h内处理，以避免细菌生长、细胞裂解、RNA和蛋白的降解以及沉积物的形成。在实际研究中，如不能立即分离EV通常需要将尿液离心预处理后在-70 ℃或更低的温度下冷冻保存，离心可去除细胞、大的细胞碎片和尿调素，避免这些杂质对后续EV分离造成影响。尿液EV分析所需的尿液量取决于EV分离方法产率和检测方法灵敏度，但10~30 ml尿液已足够用于大多数分析研究，如RNA测序和蛋白组学分析^［17］。

3.脑脊液：脑脊液是一种富含中枢神经系统疾病相关生物标志物的样本。根据ISEV相关立场性文件和指南^{［2，12，18］}，在脑脊液EV研究中必须考虑几个特异性因素：（1）某些蛋白质（如总Tau蛋白或磷酸化Tau蛋白）在腰椎区相对于大脑水平较低，而其他蛋白质（如神经丝蛋白、淀粉样蛋白b40）在腰椎区相对于大脑水平较高，因此，收集部位（例如腰椎、椎管、脑）可能影响脑脊液样本EV蛋白标志物分布；（2）血液中的蛋白质浓度是脑脊液的200~400倍，脑脊液EV蛋白标志物研究容易受血液污染；（3）影响脑脊液生物标志物的因素还包括年龄、性别、种族和使用药物；（4）对于与昼夜节律相关的生物标志物，脑脊液样本收集的时间很重要；（5）由于脑脊液样本采集方式具有侵入性、体积小且EV丰度低，其研究需要高产量的分离方法和高灵敏的检测方法^{［18, 19, 20］}。

4.唾液：健康成年人每天唾液分泌量为500~1 500 ml，并随人体病理与生理状态而变化^［21］。唾液的非侵入性采样特性使其成为一种极具优势的生物样本，尤其适用于口腔和牙周疾病研究。唾液样本收集及下游用量需求如下：采样时间应选在上午8：00—10：00，以尽可能减少昼夜节律对唾液成分的潜在影响。患者在唾液采集前8 h内应避免服用药物，采集前至少2 h不能进食、饮用饮料（水除外）、咀嚼口香糖或进行刷牙等口腔清洁操作。若采样后立即检测，唾液样本可在室温下短暂放置（30~90 min）。若采样后不能立即检测，为保持样本的稳定性，建议在采集后将样品即刻冷冻于-20 ℃环境中；若冷冻条件受限，样本可在4 ℃下保存（不超过6 h）。在-80 ℃条件下，唾液样本可以长期存放数年。采集的唾液样本经磷酸盐缓冲液处理后，需通过0.22 μm过滤器以去除细菌和大分子物质，以降低唾液中干扰成分。目前，唾液采集方法尚无统一标准，但从下唇被动引流非刺激性唾液入离心管已成为后续EV分析中最常用的唾液采集方法^{［22, 23］}。

建议2 血液体液样本中EV分析受到样本质量影响较大，包括受检者状态、采集方式、采集时间、采集后储存等。因此血液体液样本中EV研究需对各种影响因素进行详细记录，并尽量遵循标准采集及处理流程，以减少对EV分离和检测的影响（强推荐）。

实体组织释放的EV在揭示特定部位和细胞间相互作用方面具有重要价值。由于组织获取和保存方法的多样性、细胞与细胞外基质组成的复杂性，以及物理特性的变异性，组织源性EV研究面临着诸多复杂性和挑战。目前，针对组织EV的研究主要采用两种方法，并已成功应用于脑组织和肿瘤组织的研究中。第一种方法是在获取组织样本后进行体外培养，努力维持接近原位环境的条件，并从培养基中收集用于EV分离的样品^{［24, 25］}。这种EV制品可能包含来自原始组织的EV、培养过程中释放的EV，以及细胞死亡（如凋亡）过程中产生的EV，如凋亡小体^［26］。第二种方法是在组织切除后立即进行处理。这通常涉及将组织样本分割成小块（使用组织均质机、旋涡混合或切片技术），随后采用酶处理来破坏细胞外基质^{［27, 28］}。这种方法可能导致不同程度的细胞损伤，从而产生某些非原生态的假性EV。这些假性EV可能反映了细胞应激或损伤状态，而非组织的生理状态。因此，研究者在采用这些方法时需谨慎考虑这些潜在的限制和变异^［27］。

建议3 对于组织体外培养提取EV方法，应尽量保持培养条件接近原位条件，还应考虑细胞死亡过程中所产生的EV对总EV制品质量的影响。组织直接提取EV方法应建立组织特异性的处理流程，如针对组织细胞与细胞外间质分离方法（机械力或酶消化法）、特定EV分离或浓缩方法进行选择（弱推荐）。

1.超速离心法：UC法是最早应用于EV分离的经典方法，被视为EV提取的“金标准”，其利用EV与其他杂质颗粒沉降系数的差异实现EV的分离^{［29，31, 32］}。UC最常用的模式是差速离心，即通过多步不同离心力/转速的离心操作将样品内包括EV在内的各种颗粒依序分离。其另一常用模式为密度梯度离心，即使用蔗糖、重水和/或OptiPrep（质量浓度为60%、密度为1.32 g/ml的碘克砂醇溶液）等试剂制作密度梯度/缓冲垫，从而实现EV及其亚类的精细分离^［33］。UC法产物虽然具较高的纯度，但是需要超速离心机等设备，对操作人员的专业要求较高。当样本类型为血浆、血清等体液时，UC法所分离的EV仍有较高丰度的脂蛋白和白蛋白等共分离污染物。分离较大体积样品时，推荐使用UC作为分离方法。对于血浆和血清等复杂样品，虽具有一定局限性，但目前UC仍然作为分离“金标准”。为提高样品的分离纯度与产率，应进行规范的样品前处理步骤，选择合适的离心力、时间与缓冲液等参数。

2.尺寸排阻层析法：SEC又称凝胶过滤层析，是根据固定相填料孔隙的大小与样品中颗粒的斯托克斯半径（即分子在溶液中的表观尺寸）间相对关系将不同粒径的颗粒分不同组份洗出的一种色谱学方法^［34］。当不同尺寸的颗粒流经SEC柱时，EV等粒径大于填料孔隙的颗粒被排除在凝胶颗粒以外，路径较短；而蛋白质等小于孔隙的颗粒则进入其内部，路径较长，这使二者显示出不同的分配系数，进而可在不同保留时间被洗脱流出。SEC法分离EV的过程较为温和，可较大限度地保留EV的生物学活性。当使用不同填料和洗脱条件时，SEC法EV分离过程常需收集约10~30个等体积洗脱液。但是，其缺点是难以去除与EV粒径接近的共分离污染物，例如低密度脂蛋白颗粒和IgM等。SEC分离样品体积可调，广泛适用于不同类型的EV样品。在使用SEC方法时，应根据样品的性质选择分离柱、填充物类型，收集合适组份的洗脱液进行下游应用。

3.亲和富集法：亲和富集法是使用与EV表面物质亲和力强的分子，亲和并增加EV沉降系数和/或使用磁珠完成EV富集的方法。针对EV的物质组成，现已开发出针对EV表面各种物质的分离技术，其中应用最广泛的是免疫亲和捕获法。该法使用修饰有特定EV表面标志物蛋白（如CD63、CD9或CD81等）亲和分子的磁珠捕获具有这些标志物的特定EV亚群，具有较好的特异性^［35］。但是，该方法只能分离具有特定表面标志物的特定EV亚群，不能达到总EV分离的目的。亲和富集法广泛应用于特定EV亚群的分离，在不同的样品应用场景中应关注亲和分子如抗体、适配体、肽段的选择。

4.共沉淀法：共沉淀法通常使用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）或蛋白质有机溶剂沉淀剂（protein organic solvent precipitation，PROSPR）等多聚物在样本溶液中形成网状结构并结合EV，通过低速离心获得EV^［36］。该方法所需实验条件简易，操作简便，EV回收率高。但多聚物的多孔结构可结合多种脂蛋白颗粒和蛋白质杂质，令其引入的多聚物或有机溶剂可能会对后续分析产生不利影响。共沉淀法可应用于大规模的样品分离，对实验设备要求较低，常用于EV的快速富集。目前共沉淀法常合并UC、SEC等方法提高EV纯度。

5.场流分馏法：场流分馏法是利用所分析组份的流体动力学性质差异进行分离的技术，其中非对称流场-流动分馏（asymmetric flow field-flow fractionation，AF4）较为成熟。其原理是样本中不同尺寸的颗粒可在载液层流的作用下聚焦并向出口流动，在分子扩散力与垂直于载液方向上施加的外力场的共同作用下，在载液推动下依据牛顿层流特性以不同速度流向出口，据此，AF4可获得不同大小的颗粒^［37］。该法对EV生物活性保留较好，但需要配备专业仪器。场流分馏法能够精准获取不同大小的EV群体，在研究EV尺寸及其功能时推荐使用。由于其分离原理的限制，在应用于复杂的生物样品时，需考虑密度、大小和EV相似的颗粒（脂蛋白等）污染问题。

6.切向流过滤法：切向流过滤法通过使液体切向流经超滤膜表面，产生跨膜压力，将小颗粒和溶液推过滤膜，同时截留大颗粒，可有效降低样本内颗粒在滤膜上的堆积从而提高过滤效率^［38］。当作为独立分离技术使用时，切向流过滤法通常只能去除样本内粒径小于EV的杂质蛋白或颗粒。其操作简便，颗粒回收率高（可达80%），是样品和/或粗提产物浓缩的理想手段，常与其他分离技术结合使用，从而获得纯度较高的EV。切向流过滤法适用于大部分生物样品特别是大体积样品的快速分离，但同步处理多个样品的能力不足。

7.阴离子交换色谱法：阴离子交换色谱法利用阴离子交换填料上的可交换离子与EV等带电荷物质间的电荷作用力不同，从而达到分离EV的目的。上样后，EV因其带负电荷可与带正荷的阴离子交换填料结合，而它们的结合作用是可逆的，在改变pH值或者用离子浓度逐渐增加的缓冲液洗脱时，阴离子交换填料上结合的EV或其他物质可与洗脱液中的离子发生交换从而被洗脱到洗脱液中。由于不同物质的电荷不同，其与阴离子交换填料的结合能力也不同，所以被洗脱到洗脱液中的顺序也不同，可被不同离子浓度的洗脱液逐渐分离出来，从而可以利用阴离子交换法实现EV的提取及纯化^{［39, 40］}。通过不同离子浓度缓冲液的梯度洗脱，还可在一定程度（表面基团的不同）上实现EV的纯化及细分^［41］。阴离子交换色谱法适用于大量液体如细胞培养上清的处理，但要求样品中没有太多杂蛋白混杂，比如培养细胞需要用无血清无蛋白的培养基；另外终产品中会混杂部分和EV带同样电荷的蛋白，可以根据不同的下游应用场景进行综合评估。

建议4 EV目前仍然缺乏通用的特异性标志物，现有EV分离技术均不能在纯度、特异性、回收率、操作复杂度和经济性等方面取得完美的平衡。据此，研究者应明确临床或科学问题，可考虑以特定的、标准化的EV分离方法或方法组合作为基线，以评价所分离EV的科学或临床价值，从而有效推动EV领域研究成果的临床转化。在大规模的细胞上清、大体积的血液体液等生物样品的分离时推荐选择超速离心法、切向流过滤法和阴离子交换色谱法；小体积样品如泪液、唾液、脑脊液等样品推荐尺寸排阻法；研究特定EV亚群时推荐亲和富集法（强推荐）。

1.超声纳滤法：超声纳滤法通过负压振荡结合双耦合超声振荡系统作用于纳米超滤芯片上，其可将样本中的游离核酸与蛋白等杂质通过纳米孔快速去除，同时EV可被截留，实现EV的富集和纯化，可有效提高分离纯化的处理速度和纯度，并保持EV的生物活性，可实现自动化EV分离，适合临床应用^［42］。该方法可分离不同尺寸的EV亚群，但目前没有实现特异标志物的EV亚群分离。超声纳滤法具备高效的纯化速度，在小体积、珍贵生物样品的分离上具备优势。

2.多肽探针捕获法：多肽探针可通过其苯丙氨酸残基填充不对称拉伸双分子层产生的缺陷，经静电相互作用与富含磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）的弯曲膜结合^［43］，探针偶联磁珠后，可实现多种样本类型的EV分离。多肽探针捕获法可分离较高纯度的EV群体，但由于PS在膜上分布不均一、数量差异大，导致其分离效率差异较大。

3.脂质探针捕获法：脂质探针可插入EV的脂质双分子层，从而识别和捕获EV^［44］。例如，在锆基有机金属骨架上修饰可切割脂质探针，组装成一种特殊的微载体，其通过脂质探针捕获EV，再通过DNA酶切割脂质探针以释放EV^［45］。基于脂质探针进行EV的捕获能够尽可能获取完整的EV群体，在肿瘤EV异质性分析、EV核酸研究分析等方面具有优势。

4. 二分式尺寸排阻层析法（dichotomic size exclusion chromatography，dSEC）：dSEC是一种改良的SEC法^［46］。其特点是可将复杂的SEC多组份分离合并操作简化为一步洗脱即可获得高纯度EV，其也可同时回收富EV组份和非EV组份。dSEC提升了SEC法的分离纯度和操作便捷性，目前在不同样品EV分离的应用较少，仍需更多的研究支持。

建议5 以上新兴EV分离方法在保留EV生物学活性、纯化速度、操作便捷性、样本体积要求等方面，较常用EV分离方法具有一定优势。超声纳滤法在基于尺寸的EV亚群分离中优势显著，适用于EV亚群组成分析，但存在非膜性颗粒污染情况；多肽探针捕获法和脂质探针法适用于EV总群的分离，然而需注意其识别靶点具有脂膜亲和性，可能存在脂质成分污染；dSEC是简化改进的SEC技术，其应用还需更多地探索与研究（专家意见）。

1.形貌、粒径、颗粒浓度的常规表征技术：透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）、扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）和原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）等是在单颗粒水平对EV形貌、粒径等物理形状进行表征的传统技术，存在样本制备繁琐、分析速度慢、粒径分布缺乏统计代表性等缺点^{［47, 48, 49］}。冷冻透射电镜（cryogenic transmission electron microscopy，cryo-TEM）可以保持EV膜结构的完整性，在接近天然状态下对其进行分析，但极其昂贵的仪器装备、严苛的技术要求等缺点使得cryo-TEM远不能满足EV的日常表征需求^［50］。

近年来，动态光散射技术（dynamic light scattering，DLS）、纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis，NTA）和可调电阻脉冲传感技术（turnable resistive pulse sensing，TRPS）等常被应用于EV粒径和颗粒浓度的快速测定^{［47，51, 52］}。其中DLS是一种非单颗粒的表征技术，其局限性在于样本中的大粒径杂质颗粒或囊泡会湮没小粒径EV的信号，导致测得的EV粒径与真实分布存在较大偏差^［51］。NTA通过追踪颗粒的布朗运动轨迹，结合Stokes-Einstein方程计算EV的水合粒径，并同时根据视野中的颗粒数量计算颗粒浓度。由于NTA将纳米颗粒在三维空间的布朗运动投射到二维平面，使得扩散路径小于真实值，因此其粒径测定结果偏大^［51］。TRPS是一种利用纳米孔技术对溶液中纳米颗粒的粒径分布和浓度在单颗粒水平进行快速测定的技术，其局限性在于EV的宽粒径分布可能导致纳米孔的堵塞并妨碍进一步测量^［52］。

2.流式细胞术（flow cytometry，FCM）：FCM是一种对悬液中的细胞或细胞大小的微粒进行快速定量分析或分选的技术^［53］。当其应用于EV分析时，散射光可揭示EV的大小或颗粒度信息，是表征EV粒径分布最直观的参数。然而目前仅有少数高端FCM可实现粒径300~500 nm的单个EV的散射光检测^［54］。

建议6 EV形貌的基本表征需求可选用TEM、SEM等，对于需要保持EV膜结构完整性的研究，表征EV更精细的天然结构，cryo-TEM是一种选择。对于需要快速测定EV粒径和颗粒浓度的实验，NTA、TRPS以及可实现单个EV的FCM是较为适合的选择。在实验设计中，研究者应根据具体研究需求，综合考虑不同技术的优缺点，选择最适合的物理鉴定技术，以确保获得准确、可靠的EV表征结果（弱推荐）。

1.蛋白常规表征技术：蛋白质免疫印迹（western blotting，WB）和酶联免疫吸附测定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）是最常用的EV蛋白表征技术^{［55, 56］}。然而，WB存在所需EV用量大、操作繁琐、实验流程长等缺点^［55］。ELISA由于使用了一对组合抗体，提高了EV蛋白检测的特异性。不过，这两种技术均只能对已知蛋白进行定性或定量表征^［56］。

质谱技术（mass spectrometry，MS）可实现EV蛋白表达谱的检测，被广泛运用于各种疾病诊断或预后标志物的鉴定与筛选。然而，质谱检测灵敏度往往不如基于抗体的特异性表征技术，需要使用WB或ELISA技术进一步验证鉴定蛋白。

2.FCM：在EV研究中，FCM通过荧光标记的抗体或荧光探针与EV表面的特定蛋白质结合，使得EV能够被流式细胞仪检测和分析。这种方法可以定量分析不同类型EV的含量，甚至能够分辨大小、表面标记和组成成分的差异。此外，FCM结合流式分选技术，还能够从复杂样本中分选和纯化特定亚群的EV，为后续的功能研究提供了支持^［53］。

建议7 对于已知蛋白的定性或定量表征，可选用WB或ELISA技术。对于未知蛋白的全面表征，推荐使用MS对EV蛋白进行分析，随后使用WB或ELISA进一步验证。在需要多参数分析、亚群分析和分选的实验中，推荐使用FCM。在选择蛋白检测技术时，应根据实验目的、样本特性和需求灵活运用不同技术，以获得准确、全面的EV蛋白信息（弱推荐）。

1.高通量测序技术：高通量测序技术又称下一代测序（next generation sequencing，NGS），可以实现EV中所有核酸片段的高通量测序分析，适用于新型核酸序列的发现与核酸生物标志物的筛选^［57］。然而，大规模的测序数据往往需要复杂的数据分析流程，且测序结果受前期核酸制备方案的影响较大。

2.qPCR及RT-qPCR技术：定量聚合酶链反应（quantitative-polymerase chain reaction，qRCR）及逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription-quantitative PCR，RT-qPCR）可分别检测EV中特定DNA或RNA的数量和表达水平，被广泛地应用于EV核酸标志物的检测^［58］。然而，这两种技术均在集权平均水平对核酸进行表征，无法揭示核酸在不同EV中的异质性分布。

3.数字PCR技术：数字RCR（digital PCR，dPCR）是利用微流控技术将核酸检测靶标随机分配到大量相互独立的反应单元中，可实现EV DNA及RNA的数字化分析^［59］。与传统的荧光定量PCR相比数字PCR技术具有抗干扰能力强、不依赖标准曲线和单分子绝对定量等优点，显著提高EV核酸检测的灵敏度。近年来，dPCR技术被广泛地应用于稀有EV核酸标志物检测，有望进一步应用于早期临床诊断等研究^［60］。

建议8 在分析EV核酸时，NGS可用于新型核酸标志物的筛选。对于已知具体核酸序列的EV核酸标志物，建议使用qPCR或RT-qPCR进行验证。若检测标本量少或核酸标志物丰度极低，建议进一步使用dPCR对其进行检测（弱推荐）。

1.单EV的FCM：单EV的FCM突破了传统流式分析仪检测粒径的极限，将检测灵敏度提高至40 nm。其在具备单EV分析能力的同时，实现了EV表面蛋白标志物的多参数检测，可加速EV特异性蛋白标志物的发现，并有望成为临床实验室单个EV分析的理想检测平台^［61］。此外，单EV的FCM还可应用于单EV核酸标志物分析，可揭示核酸标志物在不同EV中的异质性分布^{［62, 63］}。近年来，基于单EV的FCM对血浆中携带特定标志物阳性单EV的浓度测定被广泛应用于疾病的早期诊断与预后分析。

2.单颗粒干涉反射成像技术（single particle interferometric reflectance imaging sensing，SP-IRIS）：SP-IRIS通过在基底修饰靶向EV表面蛋白的抗体来捕获EV，利用基底和EV来源的两束反射光进行干涉成像^［64］。SP-IRIS生物传感平台具备高效的光学增强原理，可实现对表达特定蛋白的EV的浓度测定及粒径分析^［65］。然而，当高浓度的EV位于显微镜的横向分辨率范围内时，多个囊泡可能合并成一个大颗粒，影响EV计数、大小和形态分析。

3.液滴微流控技术：液滴微流控技术是基于两相不相容的原理，油相提供稳定的剪切力，将连续的水相反应体系分割成独立的液体反应单元，在表面活性剂的作用下稳定存在，形成离散的液滴，被广泛地应用于单分子或单颗粒数字化检测^［66］。近年来，基于液滴的微流控技术为特异膜蛋白阳性EV检测提供了新的单囊泡分析平台。并且，该技术利用微米级的液滴包裹纳米级的EV进行分析，将不受EV粒径不均一的影响，可以实现EV粒径全覆盖^［67］。

4.超分辨率显微镜：超分辨率显微镜是近年来荧光成像引人瞩目的进展，可突破光学衍射极限（横向分辨率约为200 nm，轴向分辨率约为500 nm）对生物分子和结构进行观察，从而在单EV分析领域显示了重要的应用前景。超分辨率显微成像可分为基于单分子定位的光激活定位显微技术/随机光学重建显微技术、基于受激辐射损耗技术以及基于结构光照明成像技术。此外，单分子定位技术还可以结合全内反射技术，改进成像信噪比、缩短成像时间。超分辨率显微镜可用于EV表征和功能研究，建议对样本的处理及标记进行优化，以减少非特异性数据，同时需考虑荧光分子标记对单分子定位的影响^［68］。

建议9 针对特异蛋白标志物阳性的单EV分析，超敏流式细胞术、SP-IRIS、液滴微流控技术和超分辨率显微镜均适用；针对携带特异核酸标志物的单EV 研究可选择超敏流式细胞术；液滴微流控技术可用于由于EV粒径过小或过大导致的超敏流式细胞术和SP-IRIS 无法分析的EV亚群；超分辨率显微镜可用于EV亚群表征以及与细胞互作分析，还可实现单EV单分子水平的检测（弱推荐）。