研究表明微生物群可能会调节肿瘤免疫治疗，通过16S rRNA基因测序鉴定出双歧杆菌与抗肿瘤作用相关，单独口服双歧杆菌对肿瘤控制的改善程度与程序性细胞死亡蛋白-配体1（programmed death-ligand 1，PD-L1）特异性抗体治疗（检查点阻断）相同，联合治疗几乎完全抑制肿瘤生长，树突状细胞功能增强导致CD8（＋） T细胞在肿瘤微环境中启动和积累的效应增强^[14]。还有研究表明抗生素的使用与免疫治疗阻断PD-1所致的不良反应有关，发现治疗无反应的肺癌和肾癌患者有低水平的嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila），给服用抗生素的荷瘤小鼠口服这种细菌，恢复了对免疫疗法的反应^[15]。

肠道微生物组与多种代谢物有关。有研究对3432名具有全基因组、全元基因组、人体计量学和血液代谢特征数据的中国人进行了双向孟德尔随机化分析^[16]。确定了肠道微生物组和血液代谢物之间的58种因果关系，并复制了其中的43种，粪便中颤杆菌科（Oscillibacter）和另枝菌属（Alistipes）相对丰度增加与甘油三酯浓度降低有因果关系；相反，谷氨酸等血液代谢物似乎会减少粪便中的草酸杆菌，而变形菌门成员则受到代谢物如5-甲基四氢叶酸、丙氨酸、谷氨酸和硒的影响。这项研究说明了人类遗传信息的价值，有助于肠道微生物组特征的机制和临床研究。人类健康和疾病之间的细微差异可以由宿主和微生物因素之间的相互作用所驱动。微生物组调节肿瘤的发生、发展和对治疗的反应。除了不同种类的微生物具有调节化疗药物药效学的能力外，上皮屏障及其微生物生态系统之间的共生关系对局部和远处的免疫系统有重大影响，从而显著影响肿瘤患者的临床结局。使用抗生素可减弱免疫检查点抑制剂的抗肿瘤作用，而当存在特定的肠道微生物时，可使免疫治疗的效果增强。未来的精准医疗策略可能会依赖于新的诊断和治疗工具，用来识别和纠正影响治疗效果的微生物群缺陷^[17]。

肠道微生物组成与临床反应之间存在显著关联。有研究^[18]通过整合16S核糖体RNA基因测序、鸟枪法元基因组测序和对选定细菌的定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR），分析了转移性黑色素瘤患者在免疫治疗前的粪便样本，治疗有应答者的样本中包含更丰富的细菌种类如长双歧杆菌、产气柯林斯菌和粪肠球菌。用应答者的粪便材料重建无菌小鼠可以改善肿瘤控制，增强T细胞反应，并提高抗PD-L1治疗的功效。研究结果表明肠道微生物组可能存在一个机制调控人类肿瘤患者的抗肿瘤免疫治疗。肠道微生物组的多样性和组成对免疫治疗有重要影响。大量研究^[19,20]都通过元基因组研究揭示了治疗应答者肠道细菌的功能差异，包括合成代谢途径的富集。通过免疫分析表明，在具有良好肠道微生物组的应答患者以及接受应答患者粪便移植的无菌小鼠中抗肿瘤免疫增强，对使用免疫检查点抑制剂治疗黑色素瘤患者具有重要意义，说明肠道细菌与免疫检查点阻断疗法的疗效增强有关。

肠道微生物群生物标志物在非侵入性检测上有非常大的优势。例如散发性年轻结直肠癌（young colorectal cancer，yCRC）的发病率正在增加，肠道微生物群及其对yCRC患者的诊断价值尚不明确，有研究通过16S rRNA基因测序收集了大量样本来鉴定微生物标志物，并使用独立队列来验证结果。此外，通过对样本元基因组测序进行物种水平和功能分析，发现肠道微生物多样性在yCRC中增加，黄酮裂化菌（Flavonifractorplautii）是yCRC中的重要细菌物种，而链球菌属（Streptococcus）是老年性结直肠癌的关键系统类型^[21]。功能分析表明，yCRC具有独特的细菌代谢特征。随机森林分类模型实现了强大的分类潜力，这项研究提示了肠道微生物群生物标志物作为一种非常有前途的非侵入性检测方法，例如在准确检测和区分yCRC患者方面具有潜力。

专家建议：人体微生态组学与各疾病领域尤其在肿瘤发生、发展及对治疗的影响广受关注，包括微生态在肿瘤早期诊断中扮演什么角色？微生态在肿瘤发生、发展和预后中的意义？呼吸道、肠道菌群如何转移到身体各部位及引起的炎性反应均值得研究。其中微生组学检测技术的规范化包括实验流程、质量管理和报告解读等对临床及科研研究、治疗前后识别和判断微生物群缺陷有重要意义。

目前用于疾病的诊断或治疗的微生物组鉴定检查未完全被临床接受，部分原因是微生物组的复杂性及其在疾病发病机制中的作用未能完全解读^[22]。建议微生物组分析的临床应用应包括艰难梭菌相关疾病的管理和治疗^[23]；伴肠道菌群失调的肿瘤放疗相关放射性肠炎可能需要行肠道微生态营养干预的患者^[24,25]；化疗后粒细胞缺乏发热暴露于广谱抗生素患者；近期胃肠道手术出现顽固性腹泻患者^[26]。拟进行粪便移植或益生菌预防或治疗患者^[27]。肠道微生物菌群在免疫稳态中的作用可能会影响异基因造血干细胞移植后免疫重建，是调整移植后免疫相关策略的重要监测指标^[3]。潜在适应症包括需要分析细菌多样性为患者疾病是传染性还是非传染性提供线索。微生物组的改变与肥胖、糖尿病和炎症性肠病相关性研究分析或可能成为治疗这些病理状况的重要参考^[28]。

目前肠道微生态检测方法主要有16S rRNA测序、元基因组测序和基于纳米孔测序的全长基因测序。16SrRNA测序相对简便，成本较低，元基因组测序涵盖范围更全面，能鉴定微生物到菌株水平。由于成本关系，16S rRNA测序在肠道微生态检测中应用更为广泛。

见图1。

专家建议：标本采集建议能取粪便内部位置多点取样，一方面能避免污染，另一方面能更真实的反映肠道内部的微生物情况；为保证肠道菌群的稳定性，建议取样后立即加入肠道菌群保藏液，保藏液可迅速裂解肠道菌群以达到固定作用，避免肠道菌群体外增殖大大改变了肠道菌群的原始状态，保藏液一般可以帮助肠道菌群在常温保存一周内保持稳定。

实验室应使用经过性能确认的核酸提取试剂，推荐使用商品化的DNA抽提试剂盒，建立完整的核酸检测流程，确保提取方法的可重复性和提取效率。DNA的降解程度和各种杂质的污染均会对检测结果的灵敏度造成影响，通过测定核酸的浓度、纯度和完整性，制定合格样本的标准。操作过程中严格遵守无菌操作，污染防控对标本检测结果的质量控制至关重要。每批实验需要包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。DNA合格样本参考：DNA的A₂₆₀/A₂₈₀在1.7～1.9之间，A₂₆₀/A₂₃₀大于2，DNA质量可用1%琼脂糖凝胶电泳验证（无拖尾、无杂带、无蛋白污染）。DNA完整性可使用分析仪等进行检测，如果大部分片段低于200 nt，说明DNA降解严重，需要进行重提DNA^[32]。

文库制备流程一般包括核酸片段化、末端修复、标签接头连接和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）文库等。文库制备对核酸样本有严格要求，每次提取的核酸样本需要进行定量检测，起始核酸量定量≥0.1 ng/μl，确保核酸可以满足实验要求。若不满足重新提取核酸或再次送检样本。目前常用的建库方法有酶切建库、超声波打断建库及转座酶建库等。推荐使用经过性能确认的建库试剂或商品化的建库试剂盒。文库质量直接影响测序数据质量，文库DNA质量合格参考：A₂₆₀/A₂₈₀在1.75～2.00之间，文库浓度≥1 ng/μl，若不满足需要重新构建文库。此外，还应使用Agilent 2100或其他生物分析仪器检测文库片段大小及峰型，合格文库插入片段长度大于100 bp，文库应有明显主峰、无杂峰、无引物二聚体、无接头。若不满足重新构建文库或重新提取，如还不合格需要重新送检样本。

目前常用的方法有Qubit荧光计、实时荧光定量PCR等。推荐使用实时荧光定量PCR方法，可使用NGS定量PCR检测试剂盒，如针对Ion Torrent平台可使用Applied Biosystems公司的Ion Library® TaqMan Quantitation Kit，针对illumina平台可使用KAPA公司的KAPA Library Quantification Kit。

目前国内实验室通常采用的NGS测序平台有Illumina、Thermo Fisher和MGI等，每个平台有不同型号的设备配置。测序检测前需根据测序平台确定相应的数据参数，并根据测序片段的长度、检测标本的数量、标本的质量和最低测序深度等因素选用合适的芯片，以保证本次测序结果数据质量合格。推荐使用商品化的上机试剂盒。在检测过程中，可分别根据所用芯片容量、构建文库片段大小等指标判断所得读长总数、测序平均读长等数据是否合理。不同测序平台的参数要求会有差异，根据IonTorrent（Thermo Fisher）测序仪官方建议，使用该仪器检测的离子球粒子密度（ion sphere particle density，isp density）>70%，低质量（Low Quality）<15%，Q20>90%，建议16S rRNA测序时，为保障数据的可信度，16S-V4读长（reads）数不低于10万；16S-V3V4 reads数不低于5万^[33]。Illumina和MGI等要求Q30>85%。

16S rRNA测序通常采用PCR技术对16S rRNA的V2、V3、V4、V6、V7、V8、V9高变区进行扩增，扩增产物进行定量，经末端修复后加上特异性接头进行扩增，完成测序文库的构建。检查肠道菌群16S测序质控是否合格：质控合格后，最终将得到片段长度在200、250、300 bp左右处有3个峰的直方图。元基因组测序则是通过对微生物基因组随机打断，然后在片段两端加入接头进行扩增，文库片段主峰在300～500 bp之间，上机测序后通过组装的方式将小片段拼接成较长的序列。

肠道微生态总览指标应包含检测者和对应年龄段健康人的水平对比图、肠道菌群紊乱整体风险、多样性、功能核心菌群、肠型类型、食源性致病菌及其他致病菌评估、有益菌评估、中性菌评估、产丁酸菌评估等。

大量文献表明肠道菌群的变化与多种慢性病发生发展程度有关，同时疾病的相关治疗的预后也发现肠道菌群可以作为相关预测生物标志物，根据大阵列临床样本的差异标志物建立相关模型来预测相关疾病风险及相关治疗效果评估具有一定的可行性。在建立模型以及验证模型的可靠性时需要考虑区域差异、年龄差异，对于相关健康人基线的设立建议1 000以上的健康中国人数据作为正常范围参考评估且包含3个以上中国代表性区域人群。肠道菌群相关疾病包括：婴儿（出生～1岁）：肠绞痛、自闭症、哮喘；幼儿（1～4岁）：自闭症、哮喘、过敏性皮炎；儿童（5～11岁）：消化道类疾病、神经类疾病（自闭症）、过敏性皮炎；少年（12～18岁）：消化道类疾病、神经类疾病（自闭症）、过敏性皮炎；青年（19～35岁）：消化道类疾病、神经类疾病（自闭症、抑郁症）、非酒精性脂肪肝、痛风、多发性硬化症；中年（36～59岁）：消化道类疾病、神经类疾病（自闭症、抑郁症）、癌症（肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌）、非酒精性脂肪肝、痛风、多发性硬化症；老年（60岁以上）：消化道类疾病、神经类疾病（阿尔兹海默、帕金森、中风）、癌症（肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌）、非酒精性脂肪肝、痛风、多发性硬化症；孕妇（18～45岁）：妊娠期糖尿病、先兆子痫、产后抑郁、肝内胆汁淤积症；注：消化道疾病有（溃肠性结肠炎、便秘、肠应激综合征、结直肠癌）^[57]。

人体肠道微生物中含量最多的两个门为厚壁菌门（firmicutes，F）和拟杆菌门（bacteroides，B），两者占了整体的90%左右。厚壁菌门/拟杆菌门（F/B）可以大致反应肠道菌群的平衡状态，间接推断宿主的食物类型和代谢类型。与宿主的食物类型密切相关，高脂，高糖，高蛋白的饮食通常F/B的比例也高，高纤维食物则会使F/B的比例降低。同时，有文献报道：F/B与高血压、肥胖等多种疾病正相关。高脂高糖的西式饮食可增加肠道厚壁菌门（firmicutes，F）和减少拟杆菌门（bacteroides，B）的数量，F/B比值偏高会导致肥胖风险。肠道菌群深度参与肠道内营养物质代谢包括碳水化合物代谢、脂质代谢、氨基酸代谢、维生素合成等。通过评估肠道菌群营养代谢能力，可指导受检者根据自身代谢情况来调整饮食习惯，改变生活方式。达到改善健康状况的目标。

放射性肠炎（RE：Radiation Enteritis）是盆腔照射受者放疗最常见的并发症。2019年中国已有研究结果显示接受盆腔放疗的患者肠道微生物谱的变化与放射性肠炎具有紧密型关联。放疗期间收集了18名宫颈癌患者的粪便样本，使用IluminaHiSeq平台的16SrRNA测序后分析发现，在RE患者中观察到微生态失调，其特征是a多样性显著降低变形菌门（Proteobacteria）、丙型变形菌纲（Gammaproteobacteria）的相对丰度较高，拟杆菌属（Bacteroides）的相对丰度较低。在后来发展为RE的患者中，粪球菌属（Coprococcus）、脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、普雷沃菌属（Prevotella）、巨单胞菌属（Megamonas）在放疗前明显高于健康人，拟杆菌属（Bacteroides）在放疗前明显低于健康人。此研究结果表明，肠道微生物群的失调会促进患者放疗后出现RE。肠道微生物群的某些细菌可以作为预测RE、评估放疗的治疗效果的有效生物标志物^[58,59]。另外，2020国内最新研究结果显示聚山梨醇酯80（polysorbate 80，P80）等食品添加剂会加剧辐射诱导的胃肠道（gastrointestinal，GI）毒性。16SrRNA测序发现，P80消耗改变了肠道微生物群的丰度和组成，导致严重的辐射诱导的胃肠道损伤。进一步发现，丁酸盐是膳食纤维肠道微生物发酵的主要代谢物，通过激活G蛋白耦联受体（G protein-coupled receptors，GPCR）和维持受照射动物的肠道细菌组成，对P80加重的肠道毒性表现出有益作用，可减轻放疗相关不良反应，如果肠道中产丁酸盐的菌较多，有利于放疗后的恢复^[60]。

化疗药物除了对机体组织、器官具有直接影响外，还对肠道菌群的组成有重要作用。2021年中国的一项临床研究评估了肠道菌群在预测化疗治疗效果方面的可行性^[61]，该研究检测了84名晚期直肠癌患者在化疗前后的粪便和31份健康患者样本粪便样本中肠道菌群变化。根据患者对化疗的病理反应，将患者分为有效组和无效组，发现在化疗有效组中产生丁酸盐的微生物（Roseburia、Dorea和Anaerostipes）和显著上升，而化疗无效组中红蝽菌科（Coriobacteriaceae）和梭菌属（Fusobacterium）显著上升，这些生物标志物可以有效评估化疗的治疗效果，通过微生物多样性分析发现，化疗前化疗无效组的微生物多样性低于化疗有效组。一项研究^[62]揭示了Prevotella和3-0x0可以促进结肠癌的恶性进展，逆转氟尿嘧啶加叶酸联合奥沙利铂方案（FOLFOX）的抗癌作用，且其可能是FOLFOX个体化疗效差异的原因。一项回顾性研究在118例接受PD-1/PD-L1单抗治疗的非小细胞肺癌患者中发现，在治疗前半年内或治疗期间同时使用丁酸梭菌MIYAIRI 588治疗，可显著延长无进展生存期及总生存期^[63]。亚组分析显示丁酸梭菌MIYAIRI 588治疗对于接受过抗生素治疗的患者的ICB疗效的改善作用更为明显。

现在，研究全球数千人的肠道细菌的研究人员得出了一个结论：微生物组是一个的精确生物钟，能够在几年内预测大多数人的年龄。这个"微生物组衰老时钟"可以用作基线，以测试一个人的肠道衰老速度，以及酒精、抗生素、益生菌或饮食等物质是否对长寿有任何影响。它也可以用来比较健康的人与那些患有某些疾病的人，如阿尔茨海默氏症，看看他们的微生物组是否偏离了常态。它还可以帮助人们更好地了解某些干预措施（包括药物和其他治疗方法）是否对衰老过程有任何影响。世界各地人们的肠道细菌存在巨大差异，所以我们可以利用中国人的不同年龄段健康人群的肠道菌群的数据可以更准确地了解中国某一个人的真实生物年龄和健康状态以及神经发育状态^[64]。

应用药物（抗生素）时间较长后会导致肠道菌群平衡失调包括有益菌和中性菌减少、有害菌增多以及菌群多样性降低，同时当人体长期用抗生素时，会产生细菌的耐药性，导致抗生素的无效。基于抗生素耐药基因的检测，临床医生可以给出合理使用抗生素的使用或者合适的微生态干预方法的建议^[65,66]。