非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2024版）

国家病理质控中心 中华医学会病理学分会 中华医学会肿瘤学分会肺癌学组 中国抗癌协会肺癌专业委员会 中国胸部肿瘤研究协助组
Pathology Quality Control Center Chinese Society of Pathology Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer Chinese Thoracic Oncology Group
梁智勇（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科，北京100730），Email：liangzy@pumch.cn 吴一龙（广东省人民医院肿瘤内科 广东省肺癌研究所，广州 510080），Email：syylwu@live.cn 陆舜（上海市胸科医院 上海交通大学附属胸科医院肿瘤科，上海 200030），Email：shunlu@sjtu.edu.cn Liang Zhiyong (Department of Pathology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100730, China), Email: liangzy@pumch.cn Wu Yilong (Department of Oncology, Guangdong Provincial People′s Hospital and Guangdong Academy of Medical Sciences, Guangdong Lung Cancer Institute, Guangzhou 510080, China), Email: syylwu@live.cn Lu Shun (Department of Oncology, Shanghai Chest Hospital, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200030, China), Email: shunlu@sjtu.edu.cn

执笔人：师晓华（中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科，北京 100730）；应建明（国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院 北京协和医学院 肿瘤医院病理科，北京 100021）

靶向治疗及免疫治疗在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的治疗中发挥了重要的作用，分子分型是NSCLC实施治疗的前提。检测的标准化可提升检测结果的准确性，使患者更大程度上获益。自《非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）》制定发布以来［1］，对如何选择检测人群、检测标本与检测方法，以及制定、优化规范化检测流程起到了指导作用。随着临床对分子病理检测内涵需求的不断增加，尤其是我国临床实践数据的不断积累、新型治疗药物及适用人群的扩展，亟待对NSCLC分子病理检测的实践指导内容进行更新。

本指南一贯基于国内临床实践数据及结合中国国情，以国内已上市治疗药物及体外诊断检测试剂为导向制定，重在对分子病理检测实践的指导。2024版指南在2021版指南框架的基础上，更加着重基于循证医学证据，针对临床病理问题进行全面文献检索后，对证据质量进行分级，同时由专家委员会委员针对推荐意见进行推荐级别投票。指南更新内容包括分子病理检测人群的更新，增加了表皮生长因子受体（EGFR）外显子20插入突变作为必检位点，增加了RET、BRAF及NTRK基因变异作为必检基因变异，优化了检测策略，具体内容见下文。

本指南由国家病理质控中心、中华医学会病理学分会、中华医学会肿瘤学分会肺癌学组、中国抗癌协会肺癌专业委员会、中国胸部肿瘤研究协作组牵头。本指南成立了多学科工作组，涵盖病理科、呼吸内科、胸外科、肿瘤内科等多个学科的专家。根据职责分为指南指导委员会、执笔人、专家共识组和证据评价组。所有工作组成员填写了利益声明表，均不存在与本指南直接的利益冲突。

通过系统检索国内外NSCLC分子病理检测领域已发表的指南和系统评价，工作组初步拟定了8大类关键问题框架，涵盖40个临床问题，以在线问卷的形式对临床问题的重要性进行调研和评分。最终遴选出本指南拟解决的38个临床问题。

指南证据检索及评价小组，针对最终纳入的关键临床问题，按照人群（临床问题）、干预（测试指标）、对照（参考指标）和结局原则进行检索，具体检索数据库包括PubMed、Embase.com、Clinicaltrial.gov、Cochrane Library、Web of Science、中国知网、万方数据知识服务平台、维普资讯网和中国生物医学文献数据库。对检索到的相关文献进行归纳整理及数据提取，使用推荐意见分级的评估、制定及评价（Grading of Recommendations Assessment Development and Evaluation，GRADE）方法对证据质量进行分级［2］。指南制定工作组基于证据检索与评价小组提供的国内外证据，同时考虑我国筛查目标人群的偏好和价值观、筛查措施的成本和利弊后，初步拟定了临床问题推荐意见。以德尔菲法通过邮件形式发送至相关专家进行意见征询，在对推荐意见进行了进一步修改后并达成推荐意见推荐强度共识。GRADE证据质量及推荐强度分级标准参见表1。

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分级的评估、制定及评价证据质量及推荐强度分级

项目 内容
证据质量分级
高 非常有把握，观察值接近真实值
中 对观察值有中等把握：观察值有可能接近真实值，但亦有可能差别很大
低 对观察值的把握有限：观察值可能与真实值有较大差别
极低 对观察值几乎无把握：观察值与真实值可能有极大差别
推荐强度分级
强 明确显示干预措施利大于弊或弊大于利
弱 利弊不确定或无论质量高低的证据均显示利弊相当

本指南已在国际实践指南注册与透明化平台完成注册，注册网址：http：//www.guidelines-registry.cn/，注册号：PREPARE-2022CN786。

 一、NSCLC分子病理检测的内容及临床意义

我国NSCLC患者分子变异谱不同于西方人群，主要体现在腺癌［3］，随着分子检测技术的发展和肿瘤相关通路研究的深入，越来越多的与NSCLC治疗相关的基因及位点被发现。NSCLC分子病理检测内容主要包括靶向治疗及免疫治疗相关分子改变（表2）。

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中国非小细胞肺癌（NSCLC）分子病理检测临床实践指南要点

问题 要点 推荐级别
1.NSCLC分子病理检测的内容？ NSCLC靶向治疗相关基因检测中推荐开展的必检基因包括EGFR、ALK、ROS1、MET第14号外显子跳跃突变、RET、BRAF和NTRK 强推荐
NSCLC靶向治疗相关基因检测中推荐开展的扩展检测基因包括KRAS、HER2突变，MET扩增/过表达、NRG1/2等 强推荐
NSCLC免疫治疗相关分子病理标志物包括PD-L1蛋白表达 强推荐
NSCLC免疫治疗相关分子病理标志物还包括微卫星高度不稳定性及肿瘤突变负荷 弱推荐
2.哪些患者需要进行分子检测？ 晚期非鳞状NSCLC患者推荐行靶向治疗相关基因检测 强推荐
不吸烟的晚期鳞癌活检患者，推荐行靶向治疗必检基因检测 弱推荐
NSCLC患者，如拟进行免疫治疗，推荐行PD-L1免疫组织化学检测 强推荐
拟进行术前新辅助靶向治疗的肺腺癌患者，推荐行EGFR检测 强推荐
拟进行术前新辅助靶向治疗的肺腺癌患者，推荐行ALK检测 弱推荐
非鳞状NSCLC术后患者（ⅠB~ⅢA）推荐行EGFR基因检测和ALK基因检测 强推荐
晚期NSCLC根治性治疗后完全缓解患者，建议检测MRD 弱推荐
3.常见分子病理检测方法有哪些？ 常见的分子病理检测方法包括Sanger测序、荧光原位杂交（FISH）、即时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫组织化学（IHC）、二代测序技术等
4.临床常见送检标本类型有哪些？ 检测标本优先使用肿瘤组织石蜡标本 强推荐
细胞学标本需进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后可进行检测 强推荐
对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，推荐体液检测 强推荐
5.NSCLC重要靶分子基因变异包括哪些？ EGFR EGFR基因突变检测包括常见突变、罕见突变及耐药机制检测，推荐检测方法包括二代测序及RT-PCR 强推荐
ALK 优先推荐应用IHC方法进行ALK检测 强推荐
当和其他基因（如EGFR、ROS1等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测 强推荐
当怀疑检测标本有质量问题时，优先应用FISH检测 强推荐
ROS1 当和其他基因（如EGFR、ALK等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测 强推荐
IHC检测ROS1蛋白表达用于初筛ROS1融合，临床治疗前，阳性病例需经过其他技术平台进行验证 弱推荐
ROS1重排的其他检测方法包括FISH 强推荐
RET 当和其他基因（如EGFR、ALK、ROS1等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测 强推荐
RET基因重排的其他检测方法包括FISH 强推荐
BRAF 当和其他基因（如EGFR、ALK、ROS1等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测 强推荐
IHC检测BRAF V600E蛋白表达用于初筛，阳性病例需经过测序技术平台进行验证 强推荐
MET MET第14号外显子跳跃突变推荐检测方法包括二代测序及RT-PCR 强推荐
MET扩增推荐采用FISH方法进行检测 强推荐
MET扩增推荐采用二代测序方法进行检测 弱推荐
MET蛋白过表达推荐采用免疫组织化学进行检测 强推荐
NTRK 当和其他基因（如EGFR、ROS1、RET等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测 强推荐
IHC检测NTRK融合蛋白表达用于初筛NTRK融合临床应用前，实验室应经过严格的检测流程、判读标准、质量控制和保证，阳性病例需经过其他技术平台进行验证 强推荐
NTRK基因变异的其他检测方法包括FISH 弱推荐
PD-L1 PD-L1表达的推荐检测方法为IHC 强推荐
6.如何进行检测策略优化？ 当组织样本充足时，推荐进行二代测序高通量基因检测 强推荐
在医院条件限制等情况下无法开展二代测序检测时，或考虑到检测的时效性时，推荐采用RT-PCR方法进行多基因联合检测 强推荐
在某些特殊临床检测场景中，优先推荐单基因检测 强推荐
7.室内外质控的要点是什么？ 检测实验室应在临床应用前建立及优化检测规范化流程，并进行性能验证；检测实验室应定期参加室间质评活动，每项检测项目每年至少2次；检测实验室均应设置阴阳性对照；检测实验室应指定专人负责基因检测的质量控制，定期组织人员比对、培训及数据总结和分析 强推荐
8.临床病理沟通的重要性 应建立分子肿瘤团队及运行机制，便于临床病理沟通 强推荐

推荐意见1：NSCLC靶向治疗相关基因检测中推荐开展的必检基因包括EGFR、间变性淋巴瘤激酶（ALK）、ROS1、MET第14号外显子跳跃突变、RET、BRAF和NTRK（GRADE证据分级：高；推荐级别：强推荐）；NSCLC靶向治疗相关基因检测中推荐开展的扩展检测基因包括KRAS、HER2突变，MET扩增/过表达、NRG1/2等（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

靶向治疗相关基因包括常见变异基因EGFR（30.4%~55.0%）、KRAS（8.0%~10.3%）、ALK（5%~10%），少见变异基因ROS1（2%~3%）、MET（2%~4%）、HER2（2%~4%）、BRAF（1%~2%）、RET（1%~4%），以及罕见变异基因NTRK（<1%）、NRG1/2（<1%）等。除极少数病例存在共突变外（如EGFR突变与ALK、HER2、RET、ROS1等基因变异共存），上述基因变异在同一个病例中普遍存在互斥现象［4, 5］。

目前国内已上市的靶向药物明确需要伴随诊断的基因包括EGFR、ALK、ROS1、MET第14号外显子跳跃突变、BRAF、RET、NTRK；研究数据表明有相应靶向药物但尚未在国内上市的靶基因包括HER2、KRAS、MET扩增/过表达、NRG1/2等。

推荐意见2：NSCLC免疫治疗相关分子病理标志物包括PD-L1蛋白表达（GRADE证据分级：高；推荐级别：强推荐）、微卫星高度不稳定性（MSI-H，GRADE证据分级：低；推荐级别：弱推荐）及肿瘤突变负荷（GRADE证据分级：中；推荐级别：弱推荐）。

PD-L1蛋白表达作为NSCLC免疫治疗中重要的预测生物标志物，可作为伴随诊断指导免疫治疗，也可作为补充诊断协助判断免疫治疗疗效。PD-L1表达水平高低可用于协助指导晚期NSCLC免疫治疗及ⅠB~ⅢA期NSCLC患者的术后免疫辅助治疗等［6］。NSCLC中PD-L1蛋白表达水平与PD-1、PD-L1抑制剂疗效呈正相关，PD-L1表达水平越高患者的获益越显著［7］。

DNA错配修复蛋白缺失和/或MSI-H与免疫治疗疗效高度相关，但在肺癌中极少见，发生频率仅为0.2%［8］。

肿瘤突变负荷是指特定基因组区域内每兆碱基对（Mb）体细胞非同义突变的个数（碱基替换突变和插入缺失突变的数量总和），可以间接反映肿瘤产生新生抗原的能力［9］，在一定程度上预测免疫治疗疗效，但肿瘤突变负荷目前还没有通用标准值和检测流程，涉及二代测序panel设计及算法，以及肿瘤人群数据的划分，相对复杂，临床诊疗指南推荐较弱，仅有个别检测方法获批，因此还需要更多的临床试验及真实数据的验证。

 二、检测适用人群

推荐意见3：晚期非鳞状NSCLC患者推荐行靶向治疗相关基因检测（GRADE证据分级：高；推荐级别：强推荐）。

晚期NSCLC患者中，靶分子基因检测能够有效筛选靶向药物获益人群。除肺腺癌外，靶向治疗相关基因变异在非鳞状NSCLC（肺腺鳞癌、NSCLC非特指、大细胞肺癌及肺肉瘤样癌等）中真实存在，且患者可在靶向药物治疗中获益。如EGFR基因敏感突变、EML4-ALK基因融合可发生于非腺癌的晚期NSCLC［10］；MET变异在肉瘤样癌中发生率高达22%［11］。因此，晚期非鳞状NSCLC患者推荐行靶向治疗相关基因检测，以期使这部分患者获得更多治疗方案的选择。

推荐意见4：不吸烟的晚期鳞状细胞癌（简称鳞癌）活检患者，推荐行靶向治疗必检基因检测（GRADE证据分级：低；推荐级别：弱推荐）。

不吸烟的晚期鳞癌患者中，发生EGFR或ALK变异的比例高于吸烟的鳞癌患者，且存在基因变异的晚期鳞癌活检患者可获益于靶向治疗。此外，部分由活检证实为鳞癌的患者，经术后病理证实存在肺腺癌成分。因此，推荐在不吸烟的晚期鳞癌活检患者中进行靶向治疗必检基因检测［12］。

推荐意见5：NSCLC患者，如拟进行免疫治疗，推荐行PD-L1免疫组织化学检测（GRADE证据分级：高；推荐级别：强推荐）。

多项大型多中心临床研究结果都显示了免疫抑制剂在NSCLC治疗中的持久抗肿瘤效应并使患者受益［13, 14, 15］。目前针对晚期NSCLC驱动基因阴性患者，中国已有多个PD-1/PD-L1抑制剂适用于一线、二线或以上治疗，由于肿瘤细胞PD-L1蛋白表达水平与抗PD-1/PD-L1药物免疫治疗疗效存在正相关，因此PD-L1检测结果可以指导晚期NSCLC患者接受免疫治疗的策略。除晚期NSCLC外，Ⅱ/Ⅲ期NSCLC术后患者亦推荐进行PD-L1表达水平检测，指导辅助免疫治疗［16, 17］。

推荐意见6：拟进行术前新辅助靶向治疗的肺腺癌患者，推荐行EGFR检测（GRADE证据分级：高；推荐级别：强推荐）；拟进行术前新辅助靶向治疗的肺腺癌患者，推荐行ALK检测（GRADE证据分级：低；推荐级别：弱推荐）。

对于部分可切除的NSCLC患者，可能需要通过术前新辅助治疗降期以达到更好的治疗效果［18］。目前，多数的肺腺癌新辅助靶向治疗临床试验集中在EGFR和ALK抑制剂上，并取得了一定的疗效，在切除的肺组织标本中，部分阳性病例在接受新辅助靶向治疗后达到了完全病理缓解或主要病理缓解。因此，拟进行术前新辅助靶向治疗的NSCLC患者，推荐做EGFR、ALK等基因检测。

推荐意见7：非鳞状NSCLC术后患者（ⅠB~ⅢA）推荐行EGFR基因检测（GRADE证据分级：高；推荐级别：强推荐）和ALK基因检测（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

早期NSCLC患者可以接受手术治疗，但仍有部分患者在术后会复发转移，病理分期为Ⅰb期、Ⅱa期、Ⅱb期和Ⅲa期患者的5年总生存率分别为68%、60%、53%和36%，Ⅲb期的患者则为26%［19］。对于术后非鳞状NSCLC患者，一方面，EGFR基因突变阳性患者可从酪氨酸激酶抑制剂（TKI）辅助治疗中获益；另一方面，术后患者存在复发风险，分子分型可直接指导复发后肿瘤治疗方案的选择。EGFR-TKI用于EGFR突变NSCLC患者（ⅠB~ⅢA）术后辅助治疗的策略已纳入中国临床肿瘤学会（CSCO）、美国国立综合癌症网络（NCCN）等中外诊疗指南。近期发表的临床研究结果显示，阿莱替尼辅助治疗ALK阳性ⅠB~ⅢA期NSCLC患者可显著提高无进展生存时间。因此，对于需要做术后辅助治疗的非鳞状NSCLC患者，推荐进行EGFR、ALK基因检测。

推荐意见8：晚期NSCLC根治性治疗后完全缓解患者，建议检测MRD（GRADE证据分级：中；推荐级别：弱推荐）。

MRD是分子残留病灶（Molecular Residual Disease）、微小残留病灶（Minimal Residual Disease）或可测量残留病灶（Measurable Residual Disease）的缩写。MRD阴性提示患者可能达到潜在治愈状态，而MRD阳性则意味着更高的复发风险或当前治疗反应不佳，有助于优化后续治疗策略。新近研究表明，Ⅳ期NSCLC经系统治疗后达到完全缓解的患者中，MRD阴性可以作为暂停治疗的依据，MRD转阳后再启动治疗仍能保持靶向药物的有效性［20］，因此，晚期NSCLC根治性治疗后完全缓解患者，建议检测MRD以协助指导下一步治疗。

 三、NSCLC常用分子病理检测方法

针对上述NSCLC中基因变异检测，常见的分子病理检测方法包括Sanger测序、荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）、即时荧光定量聚合酶链反应（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）、免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）、二代测序（next- generation sequencing）等（表3）［1］。实验室需使用获得国家药品监督管理局（NMPA）批准的检测试剂及仪器设备进行检测。所有分子病理检测方法均具有优缺点，也受所检基因变异类型和数量、标本类型、标本数量和质量、实验室条件等影响。有时需要行多平台检测互补和验证［1］。

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非小细胞肺癌常用分子病理检测方法主要特点比较

检测方法 检测基因变异类型 检测范围 检测标本类型 灵敏度 特异度 检测周期（d） 检测通量
Sanger测序 基因突变 检测范围内已知/未知突变 甲醛固定石蜡包埋标本（FFPE）、细胞学标本 10%~15% 基因突变“金标准” 3~5 低
荧光定量PCR 基因突变，基因重排/融合 已知突变、已知重排/融合 FFPE、细胞学标本、体液样本 1%~5% 高 2~3 有限的多基因联合检测
荧光原位杂交 基因重排、扩增 已知/未知重排、扩增 FFPE、细胞学标本 不适用 不适用 2~3 单项检测
免疫组织化学 蛋白表达 蛋白表达 FFPE 不适用 不适用 1~2 单项检测
高通量测序 基因突变、重排等 与建库检测范围有关，检测范围内所有位点 FFPE、细胞学标本、体液样本 0.1%~5.0% 高 5~7 几个到几百个基因同时检测
四、常见送检标本类型

推荐意见9：检测标本优先使用肿瘤组织石蜡标本（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

主要包括手术、活检等方法获取的标本。检测前需对肿瘤细胞比例进行评估，满足检测要求后方可进行检测。对于手术标本，优先选取肿瘤细胞比例较高的标本进行基因检测。若肿瘤细胞比例较低，可通过富集，以保证检测结果的准确可靠。优先推荐石蜡包埋标本，可进行DNA、RNA和蛋白水平的检测。新鲜肿瘤组织标本中DNA及RNA保存完好，可进行靶基因变异检测，但在开展进一步检测前，需将对应标本进行肿瘤细胞含量评估，满足要求后方可进行检测。

推荐意见10：细胞学标本需进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后可进行检测（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

优先推荐细胞学标本制作成石蜡包埋标本后进行检测。细胞学标本包括胸腔积液、经皮肺穿活检、支气管内超声引导细针穿刺活检、痰、肺泡灌洗液等。

推荐意见11：对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，推荐体液检测（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离肿瘤DNA（ctDNA），其血浆中ctDNA有更高的检出率。可用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管或用常规EDTA抗凝管（严禁使用肝素抗凝管）采集全血并进一步分离血浆。除血液外，对于部分晚期发生脑膜转移的NSCLC患者，脑脊液对颅内肿瘤的ctDNA具有富集作用，可通过腰椎穿刺获取脑脊液进行相关基因检测。与肿瘤组织相比，血液和脑脊液中的ctDNA含量很低，其基因检测具有较高的特异度，但灵敏性较差。

 五、NSCLC重要靶分子基因变异 （一）EGFR基因变异

1.EGFR基因变异类型：EGFR基因变异包括基因突变（点突变、插入/缺失突变）及基因扩增。EGFR基因突变主要发生在编码EGFR酪氨酸激酶区的第18~21号外显子，以及获得性耐药突变（包括第一、二代TKI的耐药突变T790M和第三代TKI的耐药突变C797S等）。EGFR基因扩增对选择TKI治疗目前无明确临床意义。

2.EGFR基因突变常用检测方法及主要特点：目前EGFR基因突变检测的方法有很多种，临床常用的检测方法包括RT-PCR法和二代测序等。这些方法各有优劣势，不管使用何种检测方法，均应包括EGFR最主要的突变位点外显子19缺失（19del）和外显子21点突变（L858R），还应包括外显子18点突变（G719X），外显子20插入突变和点突变（T790M，S768I），外显子21点突变（L861Q）等。EGFR外显子20插入突变发生率仅次于外显子19del及外显子21 L858R，携带外显子20插入突变的NSCLC患者对于第一、二代及第三代EGFR-TKI药物原发耐药，针对外显子20插入突变阳性NSCLC患者的新型靶向药物在临床研究中显示了良好疗效，并已有靶向药物获得NMPA批准在国内上市［21］。因此，在临床实践中应增加EGFR外显子20插入突变变异的检测。

3.EGFR基因检测临床实践常见问题及解决策略：（1）常见突变位点：目前中国已上市的RT-PCR体外诊断试剂盒主要包括EGFR外显子18~21常见突变类型（20~40多种）。（2）罕见突变位点：随着二代测序检测普遍应用于临床检测，越来越多的罕见突变位点被发现，尤其是外显子19插入突变和外显子20插入突变，约占全部EGFR突变的5%。以上EGFR罕见突变对TKI靶向药物治疗敏感，EGFR基因罕见位点的检测也有助于正在研发中药物的临床试验入组。EGFR外显子20插入突变变异亚型众多，不同变异形式在治疗方案选择和疗效反应方面可能存在差异。目前国内已经批准用于肺癌基因检测的RT-PCR试剂盒仅能覆盖2~15种EGFR外显子20插入突变变异形式［22］。因此，对于传统方法检测的驱动基因阴性晚期肺腺癌患者，推荐进行二代测序检测。（3）耐药机制检测：目前EGFR-TKI的耐药机制已经基本明确，大部分是由EGFR T790M的获得性突变，约占50%。其他机制包括MET基因扩增、KRAS突变、BRAF突变、融合基因等。因此，对于TKI耐药患者，优先推荐进行二代测序检测耐药机制。另外，组织学形态的转化（如小细胞癌、鳞癌）也是TKI耐药机制之一［23, 24］。

推荐意见12：EGFR基因突变检测包括常见突变、罕见突变及耐药机制检测，推荐检测方法包括二代测序及RT-PCR（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

 （二）ALK基因变异

1.ALK基因变异类型：ALK基因变异类型包括基因重排/融合，以及获得性耐药突变（点突变为主）。ALK重排最常见的类型是EML4-ALK，目前至少发现了20多种EML4-ALK融合变异亚型。此外更多少见/罕见的ALK融合伴侣不断被发现［25］，如TFG、KLC1、KIF5B、SOCS5、H1P1、TRP等。上述ALK基因重排均可导致融合基因/蛋白的表达，提示适用于抗ALK抑制剂靶向治疗。尽管有研究结果显示不同的变异亚型可能与抗ALK治疗的无进展生存时间相关，但不同研究的结果存在差异，其临床意义尚待我们进一步研究［26, 27］。ALK激酶区的获得性突变是ALK抑制剂治疗耐药的主要机制之一，这种耐药性突变包括L1196M、L1152R、G1202R、G1269A、1151Tins、S1206Y、C1156Y、F1174C和D1203N，其中，L1196M最为显著，不同耐药突变类型对耐药患者的后续临床用药具有一定的指导意义［26］。ALK融合更易发生于年轻女性、从不吸烟的肺腺癌患者，病理组织学形态多为伴有印戒细胞样实性生长方式或黏液筛状生长方式的腺癌。

2.ALK基因变异常用检测方法及主要特点：ALK基因重排导致ALK融合基因的表达，可以在多个分子水平上进行，包括FISH在DNA水平上检测ALK基因重排；RT-PCR检测ALK融合mRNA；IHC检测ALK融合蛋白表达，以及二代测序检测DNA水平上的重排序列或mRNA水平上的融合序列。比对研究证实各检测平台间存在较高的符合率，但也存在各检测平台结果不一致病例。当对ALK融合基因进行筛选时，以上4种方法均显示出良好的灵敏度、特异度和一致性。有多种IHC抗体可用于ALK融合蛋白表达检测，如5A4、D5F3、ALK1及1A4等，优先推荐应用IHC方法进行ALK检测。IHC检测方法二元结果判读标准仅适用于肺腺癌。该检测在用于鳞癌、神经内分泌癌等其他类型肺癌标本时应谨慎，疑似阳性标本需要使用其他方法进行验证。在临床实践中要警惕IHC结果判读中存在的陷阱。FISH方法是检测ALK重排的“金标准”，检测结果判读直观，对样本质量要求较低，但费用较高、经济效益比不佳。并且在FISH判读时，对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐用于复核检测。基于RT-PCR方法的ALK融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，但因为RT-PCR只能检测已知ALK融合基因类型，所以存在假阴性。另外，由于RT-PCR基于mRNA扩增技术，因此实验室内、外部质控等应制定最严格的技术标准，防止污染。ALK基因融合通过捕获平台在DNA/RNA水平或扩增子平台在RNA水平上进行检测。基于捕获平台检测结果的灵敏度和特异度均很高，而且能够检测到包括已知和未知位点在内的ALK重排，但是其准确性可能会受捕获探针覆盖区域、覆盖度、标本DNA质量，以及生物信息学分析等关键因素影响。另外，极少数情况下，在DNA水平上检测到的基因重排（如intergenic translocation）可能并不会引起融合蛋白的表达。在RNA水平上采用扩增子的测序方式具有很高的检测灵敏度和特异度。但是，其检测范围一般仅局限于特定的常见位点，罕见融合可能会漏检。提取的RNA质量受甲醛固定液及标本保存时长的影响，过度降解时可能导致假阴性结果。对于质控不合格或结果不典型病例，报告时应加备注，并建议使用其他技术平台进行复检。尽管同样存在灵敏度问题，二代测序可在血液中检出ALK基因变异，注意假阴性结果的出现［28］。

3.ALK基因检测临床实践常见问题及解决策略：在进行IHC、FISH、RT-PCR及二代测序检测结果判读时，对于检测结果不能确定、信号不典型或者位于临界值的患者，应建议使用其他技术平台进行检测。

推荐意见13：优先推荐应用IHC方法进行ALK检测（GRADE证据分级：高；推荐级别：强推荐）。

推荐意见14：当和其他基因（如EGFR、ROS1等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

推荐意见15：当怀疑检测标本有质量问题时，优先应用FISH检测（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

 （三）ROS1基因变异

1.ROS1基因变异类型：ROS1是一种致癌融合蛋白，是胰岛素受体家族的受体酪氨酸激酶。ROS1基因变异包括ROS1基因重排，发生在ROS基因外显子32、34、35、36或内含子31、33或35的5′端的断点处。目前已发现十余种ROS1基因融合伴侣，主要包括CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR、FIG等［29, 30］。最常见的融合伴侣依次是CD74（38%~54%）、EZR（13%~24%）、SDC4（9%~13%）和SLC34A2（5%~10%）。ROS1融合伴侣类型没有出现如EML4-ALK这样特别集中的融合形式。ROS1融合更易发生于年轻女性、从不吸烟的肺腺癌患者，病理组织学形态多为伴有印戒细胞样实性生长方式或黏液筛状生长方式［31, 32］。

2.ROS1基因检测方法及主要特点：ROS1基因重排/融合表达检测各种方法学与ALK相似，但IHC抗体特异度不佳，目前不能直接用于判断是否存在ROS1基因重排/融合表达，仅可用于ROS1基因重排初筛，阳性病例需采用其他检测方法进行确认［33, 34］。FISH检测是检测ROS1重排的“金标准”，但存在假阴性的可能，当融合伴侣与ROS1位于同一条染色体的邻近位置时，导致无法检测到阳性信号，如FIG-ROS1变体［35］。基于RT-PCR方法的ROS1融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与ALK联合检测，但受引物设计的影响，无法检测到罕见的融合，无法发现新型融合形式。二代测序检测ROS1基因变异可在DNA水平上检测重排序列，也可在mRNA水平检测融合序列，但由于ROS1基因序列的特殊性，基于DNA水平的二代测序检测灵敏度受文库探针设计及生物信息分析能力影响较大，应注意假阴性。

3.ROS1基因检测临床实践常见问题及解决策略：在进行FISH、RT-PCR及二代测序检测结果判读时，对于检测结果不能确定、信号不典型或者位于临界值的患者，应建议使用其他技术平台进行检测。

推荐意见16：当和其他基因（如EGFR、ALK等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

推荐意见17：IHC检测ROS1蛋白表达用于初筛ROS1融合，临床治疗前阳性病例需经过其他技术平台进行验证（GRADE证据分级：低，推荐级别：弱推荐）。

推荐意见18：ROS1重排的其他检测方法包括FISH（GRADE证据分级：低；推荐级别：强推荐）。

 （四）RET基因变异

1.RET基因变异类型：与ALK及ROS1重排一样，RET基因重排可导致RET原癌基因异常激活，从而维持肿瘤细胞的增殖和存活［36］。常见的RET基因融合伴侣主要包括KIF5B、CCDC6及NCOA4，以上的融合伴侣与RET基因同位于第10号染色体上，其他罕见的融合伴侣包括EML4、TFG、RUFY3、SHROOM3、GEMIN5、RUFY1、KIF13A等［37］。RET融合更易发生于年轻女性、从不吸烟的肺腺癌患者，与其他驱动基因变异互斥。RET融合阳性患者具有更高的脑转移发病率［37, 38］。

2.RET基因检测方法及主要特点：RET基因重排/融合表达检测各种方法学与ROS1相似，可以采用IHC、FISH、RT-PCR和二代测序等。IHC检测RET蛋白融合表达的报道均为小规模病例报道，检测灵敏度及特异度范围变异性较大（50%~100%，30%~90%）［39, 40］。目前不推荐IHC方法用于RET基因重排初筛［38］。FISH方法是检测RET重排的“金标准”，亦存在假阴性的可能，如NCOA4融合伴侣与RET位于同一条染色体的邻近位置时，导致无法检测到阳性信号。对于处于临界值分离信号、不典型分离信号等的判定需要格外谨慎，推荐利用其他技术平台复核检测。基于RT-PCR方法的RET融合基因检测具有较高的灵敏度和特异度，且可与ALK、ROS1联合检测，但受引物设计的影响，无法检测到罕见的融合，无法发现新型融合形式。基于二代测序的方法检测RET融合具有较高的特异度（98%）和灵敏度（100%），可采用基于DNA二代测序检测来识别新诊断患者和已发生治疗耐药性患者的RET融合［41］。有研究表明，基于RNA二代测序比基于DNA的二代测序更适合融合检测。但考虑到经济成本和临床可及性等因素，不建议常规实施基于RNA的二代测序进行RET融合基因检测。在基于DNA的二代测序发现的意义不明确的RET基因变异、新型融合伴侣、基因间区融合、反义融合或RET 5′端融合等情况，建议使用基于RNA的二代测序进一步验证。

3.RET基因检测临床实践常见问题及解决策略：在进行FISH、RT-PCR及二代测序检测结果判读时，对于检测结果不能确定、信号不典型或者位于临界值的患者，应建议使用其他技术平台进行检测。

推荐意见19：当和其他基因（如EGFR、ALK、ROS1等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

推荐意见20：RET基因重排的其他检测方法包括FISH（GRADE证据分级：低；推荐级别：强推荐）。

 （五）BRAF基因变异

1.基因变异类型：BRAF基因突变可导致MAPK/ERK信号通路异常活化，进而引起细胞异常增殖和分化。BRAF基因变异突变类型达40余种，主要位于CR3激酶结构域的第15号外显子及第11号外显子。在NSCLC中BRAF突变率为1.5%~5.5%，其中以BRAF V600突变最常见，占所有BRAF突变类型的30%~50%，而BRAF V600突变又以BRAF V600E最为常见（约90%）［42］。

2.基因变异常用检测方法及主要特点：目前可用于BRAF V600突变检测的方式主要包括RT-PCR、二代测序和IHC等［43］。

3.BRAF V600基因检测临床实践常见问题及解决策略。

推荐意见21：当和其他基因（如EGFR、ALK、ROS1等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测（GRADE证据分级：低；推荐级别：强推荐）。

推荐意见22：IHC检测BRAF V600E蛋白表达用于初筛，阳性病例需经过测序技术平台进行验证（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

 （六）MET基因变异

1.MET基因变异的类型：MET基因异常包括MET第14号外显子跳跃突变、MET基因扩增、MET基因点突变（主要是激酶区突变）和MET蛋白过表达等。MET基因扩增包括原发扩增和继发扩增，其中继发扩增较多见于驱动基因阳性患者经TKI治疗进展后，是EGFR-TKI治疗耐药的重要机制之一［44, 45］。目前国内已有MET抑制剂获批用于含MET第14号外显子跳跃突变NSCLC患者的靶向治疗［46］，同时针对MET基因扩增和MET蛋白过表达患者的临床注册研究正在进行中［47, 48, 49, 50］。依据现有循证医学证据，目前主要关注MET第14号外显子跳跃突变、MET基因扩增和MET蛋白过表达的检测［51, 52］。MET第14号外显子跳跃突变更易发生于肺肉瘤样癌患者中，发生率可高达22%［11］。

2.MET第14号外显子跳跃突变的常用检测方法及主要特点：MET第14号外显子跳跃突变的检测方法包括RT-PCR、基于DNA或RNA水平的二代测序等。基于RNA的二代测序或RT-PCR可直接检测缺失MET第14号外显子的mRNA，基于DNA的二代测序方法可检测导致MET第14号外显子剪切的基因变异。基于RNA的检测，如RT-PCR及RNA二代测序检测MET第14号外显子跳跃突变时，对于一些与MET第14号外显子跳跃突变功能相似的、特殊且罕见的MET变异形式会导致漏检，如Y1003位点氨基酸改变。基于RNA的检测在临床实践中应注重mRNA质量，在检测前应做好质控，如发现mRNA已经降解建议重新取材检测。DNA二代测序对MET第14号外显子跳跃突变检测受引物设计或探针覆盖及生物信息分析能力的影响，MET基因探针覆盖范围不够或生物信息分析数据库未及时更新可能发生漏检。建议二代测序检测应尽量涵盖外显子14外的如第13或14号内含子上可能发生剪切变异的区域［51］。

3.MET基因扩增及MET蛋白过表达的常用检测方法及主要特点：MET基因扩增的检测方法目前主要包括FISH、二代测序等。FISH法可区分局部扩增和多体，是检测MET基因扩增的金标准。目前，在结果的判读上尚无统一的标准，主要参考Colorado大学癌症中心（University of Colorado Cancer Center，UCCC）标准和Cappuzzo标准，在临床实践中建议尽可能采用能够区分出定点扩增和多倍体的UCCC标准。二代测序用于MET扩增检测，与FISH检测的对应性比较复杂，并可能遗漏MET多体。基于组织样本的DNA二代测序与FISH检测MET基因扩增的阳性一致性为48.0%~62.5%，基于血液样本的ctDNA二代测序检测MET基因扩增的阳性一致性为25%（局部扩增43%，多体10%）。因此，对于检测结果不能确定、有扩增信号但不典型或者位于临界值的患者，建议使用FISH进行复测。对于特殊患者人群，如EGFR-TKI耐药后T790M及其他耐药机制阴性人群，或者组织标本肿瘤细胞含量较低时，考虑到二代测序检测拷贝数变异可能存在的漏检风险，MET扩增二代测序报告阴性时，仍可考虑FISH复测［51］。MET蛋白过表达检测方法为IHC，目前国内外检测MET的抗体已有多个获得国产医疗器械产品（备案），尚没有统一的判读标准。目前临床研究的判读标准结合了相关抗体在肿瘤细胞中的表达强度和百分比。建议IHC检测结果应至少包括所使用的抗体信息、肿瘤细胞中阳性百分比和染色强度［52］。

4.MET基因检测临床实践常见问题及解决策略：在临床实践中，MET第14号外显子跳跃突变的检测，可与其他驱动基因变异同时检测，或对其他驱动基因变异阴性的患者进行单独检测。应根据可及的检测平台、样本质量及样本类型，合理选择不同的检测方法。当组织/细胞学样本充足时，推荐二代测序平台或多基因RT-PCR平台；当组织/细胞学样本不足时，可根据临床需求与临床病理特征首选相关单基因检测。DNA二代测序平台检测结果为驱动基因全阴或疑似MET第14号外显子跳跃突变时，可考虑进行基于RNA水平的RT-PCR或二代测序复测MET跳跃突变及其他融合基因。当组织样本不可及时，血浆样本也可以考虑用于MET第14号外显子跳跃突变的检测，作为补充。当出现阴性结果时，应注明假阴性的可能性，必要时建议重取肿瘤组织样本进行复测。MET扩增的检测尤其在EGFR-TKI耐药人群中，如有充足的肿瘤组织样本，可以考虑优先选择FISH。对于特殊患者人群，如EGFR-TKI耐药后T790M及其他耐药机制阴性人群，或者组织样本肿瘤细胞含量较低时，考虑到二代测序检测拷贝数变异可能存在的漏检风险，MET扩增二代测序报告阴性时，仍可考虑FISH复测。以组织为参照，血浆检测MET扩增现有数据表明其灵敏度低，在报告中应予以必要的说明，血浆检测仅供临床参考，检测阴性不能排除MET扩增。此外，鉴于MET蛋白过表达在临床治疗中具有潜在的指导价值，当肿瘤组织较充足时，可考虑IHC检测MET蛋白过表达。

推荐意见23：MET第14号外显子跳跃突变推荐检测方法包括二代测序及RT-PCR（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

推荐意见24：MET扩增推荐采用FISH（GRADE证据分级：低；推荐级别：强推荐）和二代测序（GRADE证据分级：低；推荐级别：弱推荐）进行检测。

推荐意见25：MET蛋白过表达推荐采用IHC（GRADE证据分级：低；推荐级别：强推荐）进行检测。

 （七）NTRK基因变异

1.NTRK基因变异类型：NTRK家族有NTRK1/2/3三位成员，分别位于染色体1q22、9q21、15q25不同区段，编码原肌球蛋白相关激酶TRK（tropomyosin-related kinase）家族蛋白TRKA、TRKB和TRKC。在恶性肿瘤中，TRK通过多种机制被激活，包括NTRK基因融合、TRK蛋白过表达或单核苷酸改变。NTRK基因融合是目前发现的明确致癌驱动因素［53］。NTRK基因重排在NSCLC中罕见，发生率为0.17%~0.70%，其中NTRK1重排的发生率为0.10%~0.12%，NTRK2重排的发生率为0.02%，NTRK3重排的发生率为0.08%。肺癌中常见NTRK融合方式是NTRK1-TPR基因融合，并且通常不与EGFR、ALK、ROS1、KRAS等其他致癌驱动因子同时存在［54］。

2.NTRK基因变异常用检测方法及主要特点：NTRK基因重排检测方法包括IHC、FISH、RT-PCR以及基于RNA或DNA的二代测序4种检测方法。IHC采用泛TRK抗体可通过与3种TRK蛋白C端结构域的共同抗原结合检测NTRK1、NTRK2和NTRK3融合表达，结果判读时应注意TRK蛋白在神经和平滑肌组织中有生理性表达。虽然IHC在检测基因融合方面的灵敏度和特异度并不具有优势，但对于筛选罕见变异NTRK融合并确定需要进一步进行分子检测的群体来说，是一种成本低廉且快速的方法。一项大型回顾性研究显示，IHC检测NTRK的灵敏度和特异度分别为87.9%和81.1%，该方法对NTRK1融合（96.2%）和NTRK2融合（100%）的灵敏度较高，对NTRK3融合（79.4%）的灵敏度较低，此外，IHC在不同瘤种中的灵敏度和特异度也存在差异，在肺癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌和胆道癌的特异度为100%，但在乳腺癌和涎腺癌特异度较低（分别为82%和52%）［55］。FISH是检测NTRK重排的金标准，但在区分涉及非典型位点或染色体内重排的断点方面具有限制，导致假阴性结果［56］。此外，通过FISH检测NTRK1/2/3融合需要对每个基因使用特定的分离探针进行3次单独的检测，就成本和时间消耗而言，限制了FISH作为NTRK重排筛选方法的广泛应用。RT-PCR仅能检测特定的NTRK基因重排，不能检测到融合伴侣或未知变异。二代测序具有更高的灵敏度和特异度，并可以识别新的NTRK融合。基于DNA的二代测序方法无法检测所有类型的NTRK基因融合，特别是涉及NTRK2和NTRK3的融合，因为这些基因常见的重排断裂位点位于含有大量重复元件的大内含子区域内，导致测序不足。而相较之下，基于RNA的二代测序不受内含子大小或同时涉及多个基因和外显子的融合物存在的影响。研究显示，相比基于RNA的二代测序，基于DNA的二代测序用于NTRK融合检测的灵敏度和特异度分别为81.1%和99.9%，当融合涉及检测未涵盖的断点时，会发生假阴性［55］。基于RNA的二代测序方法可以被认为是检测NTRK融合的金标准。

3.基因检测临床实践常见问题及解决策略。

推荐意见26：当和其他基因（如EGFR、ROS1、RET等）一起检测时，推荐进行二代测序或RT-PCR检测（GRADE证据分级：低；推荐级别：强推荐）。

推荐意见27：IHC检测NTRK融合蛋白表达用于初筛NTRK融合临床应用前，实验室应经过严格的检测流程、判读标准、质量控制和保证，阳性病例需经过其他技术平台进行验证（GRADE证据分级：低；推荐级别：强推荐）。

推荐意见28：NTRK基因变异的其他检测方法包括FISH（GRADE证据分级：低；推荐级别：弱推荐）。

 （八）PD-L1

PD-L1蛋白表达采用IHC方法进行检测，常用抗体克隆包括22C3、18-8、SP142、SP263和E1L3N等。目前我国已批准5种标准化的PD-L1检测商用试剂用于NSCLC中PD-L1表达水平的临床检测，包括PD-L1 IHC 22C3 pharmDx试剂盒及浓缩液、PD-L1 IHC 28-8 pharmDx试剂盒、SP142试剂盒、SP263试剂盒及E1L3N抗体。PD-L1 IHC抗体需与配套的检测系统在对应的检测平台中进行［57］。

NSCLC中，PD-L1检测所用抗体不同其阳性阈值不同；PD-L1染色阳性定义：22C3、28-8和E1L3N抗体的阳性定义为任何强度完整或部分肿瘤细胞胞膜染色，SP263抗体阳性定义为肿瘤细胞基底膜和侧膜染色，SP142抗体将阳性的肿瘤细胞和免疫细胞均纳入判断标准中。具体阈值请参照各抗体获批阈值。

不同PD-L1检测试剂盒和平台之间的一致性是临床关注的一个重要方面。研究结果显示克隆号E1L3N与22C3、28-8及SP263抗体对肿瘤细胞PD-L1检测的一致性较好，染色模式及强度与SP263相似，比克隆号SP142灵敏度更好，尤其是对PD-L1低表达病例。国外两项研究对比了28-8、22C3、SP263、SP142之间的一致性，发现22C3、28-8和SP263表现出高度的一致性，SP142检测灵敏度较低［58, 59］。国内一项研究同样显示，22C3、28-8及SP263对肿瘤细胞染色一致性较高（ρ=0.729~0.809），SP142的肿瘤细胞着色较弱，灵敏度较低［60］。

应合理安排驱动基因检测和PD-L1检测，建议同时检测。

推荐意见29：PD-L1表达的推荐检测方法为IHC（GRADE证据分级：中；推荐级别：强推荐）。

 （九）其他重要靶分子基因变异：HER2、KRAS、NRG1/2等

除了上述靶分子外，HER2基因突变或扩增、KRAS突变、NRG1/2等，均为NSCLC中重要的驱动基因变异，并是潜在的治疗靶点。他们的检测方法可参照基因点突变、基因重排类型的检测方法和检测策略，更多的尚需临床实践的积累。

HER2基因突变或扩增是NSCLC的驱动基因之一，其中最常见的基因变异为HER2外显子20插入性突变［61］，在NSCLC的突变率为2%~4%。基于Destiny Lung-01/02研究结果，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准Trastuzumab Deruxtecan用于伴有HER2基因突变的NSCLC患者［62, 63］。亚洲人群中KRAS基因突变率为8%~10%，突变位点位于第2及3号外显子，易于发生于吸烟的肺腺癌患者，KRAS突变与患者预后差、耐药等相关［64］。美国FDA已批准Selpercatinib和Pralsetinib用于伴有KRAS G12C突变的NSCLC患者。NRG1/2重排基因在NSCLC中发生率约为0.3%，常见融合伴侣为CD74［65］。

 六、检测策略优化

检测策略应该兼顾时效性和靶向基因数量，在评估患者可供检测的样本质量及能适用的检测方法后，综合考虑患者就诊时间和疾病进展情况，对初测和复测的患者选择适宜的检测策略（图1），为临床治疗决策提供最大程度的帮助。

10.3760/cma.j.cn112151-20240527-00338.F001 非小细胞肺癌常用基因检测流程图

RT-PCR：即时荧光定量PCR；FISH：荧光原位杂交；IHC：免疫组织化学；*肿瘤组织或细胞学标本检测失败时；#免疫组织化学仅用于甲醛固定石蜡包埋样本检测

推荐意见30：当组织样本充足时，推荐进行二代测序高通量基因检测（强推荐）。

相比传统的检测方法，二代测序一次实验可同时对多个靶点基因的突变、重排和扩增进行检测，从而有效地避免样本浪费、节约检测时间并相对地降低检测费用，因此，有条件的实验室推荐对初治患者使用二代测序对NSCLC的所有必检和扩展靶点基因进行筛选；对于TKI耐药患者同样推荐二代测序检测，以全面地查找耐药机制，指导治疗。

但是，需认识到二代测序平台自身的一些缺陷，必要时可使用其他单基因检测或多基因联合检测的方法并用或验证，尤其对于标本质量欠佳或二代测序检测结果全阴的样本。如DNA二代测序检测结果驱动基因阴性的样本，可以使用其他检测方法在RNA或蛋白水平复检，以保证全面地检出靶点基因变异。基于RNA的二代测序检测有助于提高融合基因检出率［66］。

推荐意见31：在医院条件限制等情况下无法开展二代测序检测时，或考虑到检测的时效性时，推荐采用RT-PCR方法进行多基因联合检测（强推荐）。

使用多种平台行多基因联合检测，如RT-PCR同时检测EGFR、ALK、ROS1、RET、NTRK、BRAF和MET第14号外显子跳跃突变。应重视多基因联合检测对各自基因变异检测的局限性（如无法检测罕见变异位点、未知变异等），必要时联合单基因检测技术。多基因联合检测平台相对二代测序检测来说，相对易于开展，且检测时效性相对较高，对于晚期急需治疗的患者来说是一个优先推荐的检测平台。

推荐意见32：在某些特殊临床检测场景中，优先推荐单基因检测（强推荐）。

EGFR、ALK、ROS1、RET均可进行单基因分别检测；在某些特殊临床检测场景中，优先推荐单基因检测：（1）对于部分晚期患者，在组织标本量极少，无法提取合格量核酸时，可进行单基因检测，如ALK免疫组织化学和/或ROS1、RET的FISH单基因检测。（2）组织标本质量欠佳，不能满足二代测序等检测要求时，应用FISH检测ALK或/和ROS1、RET重排。其余基因可考虑血液/脑脊液检测。对于第一、二代EGFR-TKI耐药患者，如样本量较少，可考虑进行T790M突变检测及MET扩增或过表达检测。

 七、室内外质控

（1）检测实验室应在临床应用前建立及优化检测规范化流程，并进行性能验证。（2）检测实验室应定期参加室间质评活动，每项检测项目每年至少2次。（3）检测实验室均应设置阴阳性对照。（4）检测实验室应指定专人负责基因检测的质量控制，定期组织人员比对、培训及数据总结和分析。

在临床操作中，行之有效的质量控制系统对于病理诊断与评估的可信度至关重要。检测实验室应在临床应用前建立及优化基因检测规范化流程，并进行性能验证［阴阳性符合率、最低检测限（如适用）等］。质量控制主要包括室内质控与室间质控。室内质控除了常规性地设立阳性及阴性对照，还包括不同检测方法比对、不同检测人员比对、新试剂性能验证及定期抽检等，以及定期进行人员培训及数据总结和分析。室内质控的主要目的就是确保实验步骤的准确性和控制实验室每次检测结果的可靠性、有效性。检测实验室应定期参加室间质评活动，每年至少2次。室间质控可以通过参加国内权威机构举办的室间质评活动来完成，也可通过与其他实验室（如已获资格认可的实验室、使用相同检测方法的实验室或使用配套系统的实验室）比对的方式确定检验结果的可靠性。

 八、临床病理沟通

应建立包括临床医师、病理医师、分子检测及生物信息分析人员等在内的分子肿瘤团队（molecular tumor board）及相关运行机制，加强临床病理沟通。沟通内容包括但不限于：（1）分子病理检测送检流程（包括基因检测前、检测后及耐药后再次检测）及分子病理报告内涵；（2）本单位检测或外送检测的肿瘤组织或细胞学标本应由病理医师进行肿瘤细胞含量的评估；（3）当存在检测结果不一致或与临床病理不符时，应与检测医师或相关人员沟通，确保检测结果均无异议时，方可进行相关治疗；（4）当需要外送独立实验室检测时，应联合对外送检测的独立实验室进行质量评价；（5）靶向药物耐药机制检测内容的制定；（6）开展定期相关专业进展学术会议。

 九、NSCLC分子病理检测展望

随着靶向治疗及免疫治疗在NSCLC治疗领域中的临床实践经验及临床研究数据的积累，将有越来越多的靶向治疗药物及免疫治疗药物应用于临床中。同时，随着分子病理检测技术的不断进步，将会有越来越多的治疗相关靶基因及位点被发现。检测技术水平的提高、高通量检测平台的普及、检测试剂盒的不断获批等将推动分子病理检测在NSCLC中的广泛应用。

在本指南制作过程中发现，与NSCLC靶向治疗药物疗效数据相比，在治疗靶点不同检测方法之间对比、病理检测标本类型对靶向治疗疗效的对比等方面，缺乏大规模前瞻性的临床队列研究，因此针对以上问题的循证医学证据质量差，未来工作中，开展基于以上问题的临床队列研究是获得高质量循证医学证据的基础。此外，罕见变异发生率低，循证医学证据相对薄弱，但中国NSCLC人群基数大，开展多中心临床队列研究可为罕见基因变异积累高质量的循证医学证据。

专家组成员（按单位名称汉语拼音字母顺序排列）：北京大学人民医院胸外科（杨帆）；北京大学医学部病理学系（张波）；北京大学肿瘤医院病理科（林冬梅）；北京医院病理科（刘东戈）；复旦大学附属肿瘤医院病理科（李媛、周晓燕）；广东省人民医院 广东省肺癌研究所肿瘤内科（吴一龙、张绪超）；国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院 北京协和医学院肿瘤医院病理科（李卫华、应建明）；哈尔滨医科大学肿瘤医院病理科（孟宏学）；河北医科大学第四医院病理科（刘月平）；河南省肿瘤医院病理科（马杰）；湖北省肿瘤医院病理科（岳君秋）；解放军总医院第一医学中心病理科（石怀银）；空军军医大学西京医院病理科（王哲）；陆军军医大学第一附属医院病理科（罗韬）；南京医科大学第一附属医院病理科（张智弘）；青岛大学附属医院病理科（邢晓明）；山西省肿瘤医院病理科（郗彦凤）；山西医科大学第二医院病理科（王晨）；上海市肺科医院病理科（武春燕）；上海市胸科医院 上海交通大学附属胸科医院病理科（韩昱晨），肿瘤科（陆舜、虞永峰）；首都医科大学宣武医院病理科（滕梁红）；四川大学华西医院病理科（蒋莉莉、唐源）；四川省肿瘤医院病理科（刘洋）；苏州大学附属第一医院病理科（郭凌川），胸外科（马海涛）；云南省肿瘤医院病理科（周永春）；郑州大学第一附属医院病理科（李文才）；中国科学技术大学附属第一医院病理科（叶庆）；中国科学院大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）病理科（苏丹）；中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院病理科（陈龙云、梁智勇、师晓华、吴焕文、武莎斐、曾瑄），呼吸科（王孟昭）；中山大学附属第一医院病理科（韩安家）；中山大学肿瘤防治中心病理科（王芳）；遵义医科大学附属医院病理科（王进京）
参考文献
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