流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测的项目不断地由科研推向临床应用领域，并在临床免疫学、血液系统疾病的诊断、治疗与复发监测方面起到不可或缺的作用。FCM在临床检验诊断中的作用越来越重要，国内开展FCM的医疗机构也越来越多，但仍存在着诸多问题，总体水平有待进一步提高。目前临床尚缺乏统一的FCM应用指导原则。为了科学、合理地将FCM应用于临床疾病的筛查、诊断、疗效监测、预后评估、复发预测等环节，中华医学会检验医学分会，卫生部临床检验中心和中华检验医学杂志编辑委员会共同决定制定FCM的临床应用建议。本应用建议在制定过程中，主要参考了美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)和欧洲临床细胞分析协作组(European Working Group on Clinical Cell Analysis，EWGCCA)等[1,2,3]学术组织关于流式细胞学临床应用的相关文件，并通过多种方式广泛征求临床血液学专家和检验医学工作者的意见，作为修改该建议的一个重要参考依据。
本应用建议最后经中华医学会检验医学分会和卫生部临床检验中心组织专家进行讨论修改后，由中华医学会检验医学分会、卫生部临床检验中心和中华检验医学杂志编辑委员会共同发布。
由于医学科学技术发展迅速，本应用建议将适时修订，以适应医学发展和临床应用的需要。
FCM是一种利用流式细胞仪对单细胞或生物颗粒进行多参数、快速分析的技术。目前，FCM越来越广泛的应用到临床检验中，在疾病的诊断、分型、治疗、预后及预防起到重要作用[4,5,6]。由于具有多参数和多变量的特点，流式细胞仪的性能状态、检验方法、试剂性能与组合搭配、检测人员专业水平等都直接影响着检验报告的质量。
使流式细胞仪处于最佳光学性能状态是FCM临床应用的技术保证。流式细胞仪应定期进行仪器设置校准，仪器性能指标如仪器的散射光、荧光检测灵敏度和分辨率以及荧光补偿等需定期监测，并做好记录。
每次开机时，用光路质控微球验证仪器的光路，用电压校准微球调整前向角散射光(forward scatter，FSC)和侧向角散射光(side scatter，SSC)及光电倍增管(photo multiplier tube，PMT)电压和增益。固定电压后，连续5 d测定荧光微球在每个光学检测通道的平均通道数和变异系数(coefficient of variation，CV)，每天不同时间点测定4次，然后计算出这些参数的均数及标准差(SD)，以均值±2SD为可接受范围。每天需记录平均通道数及CV，并与其对应的可接受范围进行比较[7,8]。
在保持激光强度、滤光片、PMT电压和增益不变的情况下，测定并记录校准荧光微球上机测定获得的平均通道数和CV。要求所有光学检测通道所使用的荧光参数为均质峰。通过连续5 d、共20次重复测定得到每一种荧光微球的可接受平均荧光强度范围。应确保流式细胞仪每个荧光检测通道都能将弱表达峰和自发荧光峰区分开。
临床FCM实验室需对仪器硬件性能进行经常性监测并做好记录。应要求流式细胞仪的供应商定期对仪器性能参数进行校准。
每次开机使用质控样品对仪器性能进行验证，包括仪器光学系统、荧光分辨率及荧光强度等。
正确的荧光补偿对于FCM至关重要。根据多色分析实际采用的荧光染料种类和数量，合理进行补偿设置[9]。目前可以用商品化的标准补偿试剂来完成多色荧光补偿，但补偿设置应尽量使用细胞样本等生物样品[10]。目前多数流式细胞仪都可进行自动补偿，但自动补偿设置好后，仍需根据实际染色方案如不同的荧光抗体、不同的标本处理步骤、阳性细胞群的选择等进行必要的调整。在补偿设置中设立正确的对照管是非常必要的。在多参数FCM分析时，推荐采用荧光缺一对照(fluorescence-minus-one control，FMO)，即标记除某一通道荧光抗体外的其他所有通道荧光抗体[6]。通过FMO管可以更准确设门，更清楚地区分出阳性和阴性细胞群。
应用多色FCM分析、仪器维护或光学电压及增益变动时均应进行荧光补偿调整。建议采用新鲜细胞样品结合FMO管并根据多色分析实际采用的荧光染料种类和数量，合理进行补偿设置。
荧光线性监测是对仪器的PMT电压进行监测，应每月进行一次或按照仪器供应商的推荐周期执行。保持与检测临床标本时相同的PMT电压设置，用已知相对荧光强度的多色荧光微球混合物上机测定。每一种微球的可接受平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)范围通过连续5 d、每天不同时间点测定4次的重复测定得到，且要求每一种荧光微球的MFI检测值相关系数≥0.98。在仪器PMT电压不变的情况下，各种荧光微球的荧光线性、MFI差异应保持不变[7]。
如果实验室有多台流式细胞仪，且需要在多台仪器上进行相同项目的测定，需进行仪器性能之间的比对。选择5～10份代表性临床标本，按照实验室标准化操作规程对标本进行染色处理和上机测定，在不同仪器上获得的检测结果应达到实验室制定的可接受区间内[1,8,11]。
仪器整体保养需半年1次，由仪器生产厂家工程师和检验人员共同完成，用户需严格按仪器说明书要求进行定期清洗保养。
定期监测荧光线性对于免疫分型和微小残留病监测时准确定量抗原表达的强度很重要。
建议相同项目检测尽量在同一台仪器上进行，但实验室有多台流式细胞仪检测同一检测项目时，建议每半年进行一次仪器间性能的比对。
FCM实验室应开展室内质量控制工作，建议用商品化全血质控，每次开机均需进行室内质控检测。目前卫生部临床检验中心已经组织开展了淋巴细胞亚群等项目的室间质评活动。美国病理学家学会(College of American Pathologists，CAP)等国际组织也有流式细胞术的室间质评项目。
建议开展临床检测项目的所有FCM实验室均进行室内质控检测，并应参加全国性或地区性的室间质量评价，有条件的实验室可参加国际性室间质量评价。
每个FCM实验室需确保淋巴细胞亚群等临床检测项目必须在精密度、灵敏度和准确性上达到一定水准[1,12]。白血病和淋巴瘤的FCM免疫分型还没有公认的标准或推荐的评价办法，每个实验室必须建立自己的评价标准[2]。(1)精密度：用于衡量单份标本荧光染色的可重复性和仪器的可重复性。建议使用正常人外周血标本测定。荧光染色的可重复性要求对同一份标本测定≥10次，结果以均数及SD表示，均数±2SD作为允许波动范围。仪器可重复性的检测要求对同一份染色标本进行≥3次的测定，要求检测结果在均数±2SD范围内。(2)灵敏度：FCM检测的灵敏度依赖于抗体滴度、仪器最佳性能状态、检测细胞数量和细胞进样速率等。(3)准确性：为确保FCM检测结果的准确度，建议通过将各自实验室的检测结果与参考实验室的检测结果进行比对，室间质评可作为实验室间准确性评估指标。(4)流式试剂的验证：临床检测项目应尽量选择体外诊断试剂(in vivo diagnosis，IVD)和分析物特异性试剂(analyte specific reagents，ASR)，而仅供研究用(research use only，RUO)试剂通常不能用于临床体外诊断。在我国，用于体外诊断的试剂必须取得国家食品药品监督管理局(China Food and Drug Administration，CFDA)认证。但目前通过CFDA认证的试剂并不多，不能满足临床需要，因此开展项目较多的FCM实验室在使用未经CFDA认证的试剂时需要自行验证试剂的实际检测性能。同时需在检验报告中声明："本检验报告依赖于本实验室自行对试剂性能的验证，该验证试验尚未得到CFDA的批准"。
推荐使用正常外周血衡量FCM检测标本荧光染色可重复性和仪器检测可重复性。FCM检测的准确性可通过将自己实验室的检测结果与参考实验室的检测结果进行比对或与金标准方法进行比对获得。
建议使用经CFDA认证批准的试剂用于临床项目检测，如果使用未批准的试剂需在检验报告中做出说明。
建议实验室应制定标本验收的目测观察程序和拒收样品的标准。拒绝接受溶血、出现凝块、采血量不足(特别是使用柠檬酸钠抗凝管时)、运送温度过高或过低、标签错误、抗凝管选择不当等标本，并做好记录，给出合理解释。实验室收到标本后应在标本采集后48 h内、细胞绝对计数样本应在24 h内完成检测。特殊试验特殊处理，如血小板活化检测应在2 h内检测完毕。
(1)样本制备：FCM检验在标本制备时需考虑标本类型及细胞数量。样本制备的基本原则：各种液体和悬浮细胞样本应新鲜，尽快检测；FCM分析时，首先要测定标本的细胞含量，计算合适的标本用量/抗体加样量比值，保证得到最佳的染色效果，细胞浓度调至最佳染色浓度(0.2～2.0)×107个/ml，每管100 μl，即(0.2～2.0)×106个/管。(2)细胞存活率检测：对于超过24 h的标本或肉眼发现已经变质的标本(如细胞碎片增多、标本浑浊等)，建议采用FCM染色评价标本的细胞存活率。细胞活力应保持在75%以上，对于不可替代的而细胞活力低于75%的标本，应采用7-氨基放线菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)组合染色方案。(3)染色过程的质控：仪器设置和性能验证完成后，应当用正常血液标本上机对染色步骤进行验证。可以使用一些抗原标志经过固定的商品化细胞产品作为质控材料，这些质控品包含了白血病免疫分型的大部分抗原标志。每一份白血病或淋巴瘤标本都含有正常细胞群，可通过分析正常细胞群作为对照细胞来判断染色效果是否合适。(4)同型对照：通常淋巴细胞亚群分析时，不需要同型对照。但是，胞质抗原染色时建议使用同型对照，可以降低由于细胞大小不同、非特异性染色不同对检验结果的影响。需注意的是，同型对照也存在非特异性结合，因此特异性标记抗体与同型对照抗体的种属、类型和制备工艺要一致。另外，不同细胞群荧光本底不同，特别是白血病细胞荧光本底较高，将正常细胞群抗原的表达与否作为对照时最好与同型对照结合，进行综合分析。
FCM多参数分析中，设门是细胞分群的关键步骤，对于流式数据分析至关重要。初步分析时应对全部活细胞进行分析；进一步分析时，将目的细胞全部圈"门"内，仅分析"门"内的细胞群。(1)设门方案：设门实际就是确定分析区域。在DNA倍体分析中，设门的原则是圈定单个细胞，排除粘连细胞。淋巴细胞分析、免疫分型以及微小残留病监测时建议采用免疫标记物加散射光的设门方案。如CD45/SSC设门用于白血病/淋巴瘤免疫分型、微小残留病监测和造血干细胞检测；CD19/SSC设门用于成熟B淋巴细胞增生性疾病的分析。(2)报告形式：流式检测的报告不仅包含结果的描述，还要给临床医生传达适当的信息[13,14]。1份完善的报告应该包括：患者信息、标本信息、标本制备和染色、结果和必要的解释。在数据分析中，百分率、荧光强度、DNA指数(DNA index，DI)、x个细胞/μl是报告中常用的形式。白血病/淋巴瘤免疫分型结果的分析，单纯的百分率结果并不能完整的反映肿瘤细胞的特性，建议以文字描述抗原有无和强弱，结合典型流式图谱的报告形式，并尽可能附上CD45/SSC流式图谱为临床医生提供更多信息[15]。(3)数据分析的均一化：为保证FCM检测的均一化和数据的共享性，建议根据不同地区的实际情况采取不同的措施。如建立地区性公共FCM检测平台，将标本集中于本地区FCM开展较好的医院集中检测；也可以分别检测[12]。同时应制定不同检测项目的FCM标准操作规程，对检测项目进行标准化和规范化。一些操作简便的第三方数据分析软件被广泛应用于流式数据的处理分析，建议利用流式细胞仪自动软件结合第三方软件进行综合分析，以保证FCM结果分析的一致性[16,17]。FCM检测数据的合理解释需要有经验丰富的检验医师参与，负责审核检测数据以及形态学检查结果。最终的诊断意见需要结合临床作出综合判断，所有的FCM检验报告必须保留至少2年。
标本制备以不丢失或损伤单个细胞为原则，同时针对不同的胞浆标记抗体建议选用不同的破膜剂和破膜方案。流式分析建议标准的细胞用量是(0.2～2.0)×106个有核细胞/管。
对保存时间较长的标本建议采用7-AAD染色评价标本的细胞存活率。利用标本中的正常细胞群判断染色效果是否合适。
选用合适的同型对照，建议优先采用IgG1型抗体。需注意同型对照也存在一定的非特异性，需谨慎选择。
淋巴细胞亚群分析是目前FCM临床应用最广泛的检测项目，最常检测的淋巴细胞亚群包括T细胞(CD3＋)、辅助性T细胞(CD3＋CD4＋)和杀伤性T细胞(CD3＋CD8＋)、B细胞(CD3－CD19＋)和NK细胞(CD3－CD16＋CD56＋)等。卫生部发布的FCM检测外周血淋巴细胞亚群指南(WS/T 360-2011)对于规范FCM在外周血淋巴细胞亚群分析具有重要指导意义。检测过程需注意标本采集和运输、免疫荧光染色、FCM检测和分析、结果报告和审核等方面。
首选乙二胺四乙酸盐(EDTA-K2/EDTA-K3)抗凝管采集淋巴细胞亚群标本，并在24 h内检测。肝素钠或枸橼酸钠抗凝血也可用于检测，但如标本同时进行白细胞计数分类，则应选择EDTA作为抗凝剂。
连续检测的同一患者应固定标本采集时间，标本采集后应立即检测，不能立即检测的标本应置室温保存。
建议选用单克隆抗体用于淋巴细胞亚群流式分析。推荐使用与仪器品牌相匹配的溶血剂，并严格按照使用说明和注意事项进行操作。如果使用无固定作用的溶血剂(如氯化铵和低渗缓冲液等)，标本标记后需保存在4 ℃，并在1 h内完成上机。淋巴细胞绝对计数时单平台法可避免双平台法中血常规计数仪可能导致的计数误差，计数时准确加入一定体积的标本和相同体积、数量已知的计数微球。
由于不同的仪器、试剂、实验室、地域和民族、年龄和性别等因素，淋巴细胞亚群的参考范围会有差别，建议每个实验室应根据本地健康人群建立本实验室的参考值范围，或是国内同一地区多家实验室联合，建立统一的参考范围。并定期验证和调整，每次验证不少于20份健康人标本[1]。
超过48 h的标本或肉眼观察发现已经变质的标本，建议使用7-AAD结合CD45进行细胞活力的评估。
建议采用单平台法进行绝对计数检测，标准微球加样应采用反式加样法，并保证同一操作者和同一移液器。
使用CD45/SSC设门进行淋巴细胞亚群分析，利用CD45高表达和SSC低的特点准确圈定淋巴细胞群。
应建立全国或地区性的、针对不同性别和年龄段的淋巴细胞亚群及绝对计数的参考值范围。成人和儿童须分别建立各自的参考范围。
随着科学研究的不断发展，依据分泌的细胞因子谱不同可将辅助性T细胞(Th细胞)分为Th1(CD4＋IFN-γ＋)、Th2(CD4＋IL-4＋)、调节性T细胞(Treg，CD4＋CD25＋Foxp3＋)、Th17(CD4＋IL-17＋)、Th9(CD4＋IL-9＋)及Th22(CD4＋IL-22＋)等多种功能不同的独立细胞亚群[19,20,21,22,23]。
功能性T淋巴细胞亚群检测时，选择肝素抗凝。标本采集后，应尽快送检。检测细胞因子如INF-γ、IL-4、IL-17、IL-9、IL-22等时应先采用佛波脂(PMA)、离子霉素(Ionomycin)、布雷菲尔得菌素(Brefeldin A，BFA)或莫能霉素(Monensin)等淋巴细胞激活剂预处理4～6 h，以使其激活、分泌因子。染色时应对细胞进行穿膜，因不同的检测要求需要不同的固定破膜剂。如果需要细胞因子和Foxp3同时穿膜染色，最好选择适宜共染的破膜剂。同型对照及未刺激对照等同时处理。目前国内有医疗机构将此作为临床项目开展，但对于其操作的标准化、参考范围以及临床结果的解释等均需谨慎。
淋巴细胞功能亚群分析的标本必须采用肝素钠抗凝。选用合适的刺激剂和刺激时间对于淋巴细胞功能亚群的检测分析至关重要，需优化条件，保证结果的稳定性和重复性。
检测Treg细胞等T淋巴细胞功能亚群分类还需进一步规范操作过程和对结果的解读。
在移植过程中，应用FCM计数CD34＋造血干细胞数量对确定采集造血干细胞的时机、判断供体细胞的植入水平、随访免疫重建状态等至关重要。造血干细胞计数的标本可来自EDTA或肝素抗凝外周血、骨髓、脐带血、外周血干细胞采集物。EDTA抗凝样本可在室温下稳定保存12～24 h，肝素钠抗凝样本可稳定保存48～72 h。样本白细胞计数应调整在4.0×109/L～10.0×109/L之间。
FCM计数造血干细胞操作中需注意：尽量减少样本处理步骤，使用适当标记的抗体，选择适当的阴性和阳性标本，收集足够细胞数以降低变异系数，采用标准设门和分析方案。设门方案建议采用血液病治疗及移植国际联合会(the International Society of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE)推荐方案[24]，用多参数(CD34、CD45、SSC和FSC)并结合逻辑设门检测造血干细胞数量。该方案适用于不同FCM实验室和不同的流式细胞仪，结果具有可比性。通常CD34＋细胞占单个核细胞的0.1%(正常外周血)到1%(正常骨髓)，在未设门的光散射图中收集50 000至100 000个细胞进行分析，保证采集100个以上的CD34＋细胞，获得比较准确的结果。
推荐采用全血溶血法进行CD34＋造血干细胞计数。建议单平台法进行绝对计数检测。
检测冻存的造血干细胞采集物和脐带血复苏标本，建议同时染色7-AAD以排除死细胞的干扰，最低活性应≥70%。
强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是慢性进行性脊椎炎症病变。已证实AS的发病和HLA-B27密切相关。采用肝素抗凝外周血标本，利用CD3设门圈中T淋巴细胞或CD45/SSC圈中淋巴细胞，检测HLA-B27的平均荧光强度。目前商业化HLA-B27检测试剂盒中，可使用荧光定量标准微球，校正HLA-B27的阳性标准后，准确测定样本中T淋巴细胞HLA-B27表达。也可采用HLA-B7/B27双标试剂同时检测B7，去除B27与B7之间的交叉，提高检测的准确性[25]。
HLA-B27检测不能作为随机选择人群的AS筛选指标。HLA-B27检测有助于AS的辅助诊断。
利用CD3设门圈中T淋巴细胞或CD45/SSC圈中淋巴细胞，并收集足够多的细胞，检测HLA-B27的荧光强度。
FCM进行免疫表型分析在血液系统肿瘤分类中主要用于：鉴别髓系和淋系肿瘤；在髓系肿瘤中，主要用于急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)和急性双表型白血病的诊断，其他类型的髓系肿瘤诊断，如骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders，MPD)、骨髓异常增生综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)则主要依据形态学、遗传学和临床表现，免疫分型只起辅助作用；在淋巴系统肿瘤如急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中，免疫表型则起重要的作用。流式细胞术对于成熟淋巴瘤和多发性骨髓瘤等血液系统疾病的检测也具有重要作用，但目前其应用标准尚未统一，因此本指南仅涵盖急性白血病的流式检测。
骨髓抽吸液和骨髓标本优先选择肝素钠抗凝。对于具有高增殖能力的肿瘤患者或已进行放、化疗患者的标本应在48 h内处理。所有的组织标本以及采集后超过48 h的血液与骨髓标本都应进行细胞活力的评估。由于运送或其他情况而推迟检测、正接受放疗或化疗的患者标本、组织标本、怀疑高增殖的肿瘤患者标本等也需要评估细胞活力。
骨髓抽吸液和骨髓标本优先选择肝素钠抗凝，应48 h内处理标本。组织培养液运送新鲜组织标本可保持细胞活力，但可增加自发荧光，应综合考虑选择。
合理的抗体组合选择对于准确、快速免疫分型分析至关重要。抗体组合涉及各种抗体所标记的荧光色素、流式细胞仪的配置等特点，因此需遵循一定原则选择合适抗体[10,26]。同一谱系细胞成熟阶段不同以及相近细胞亚群之间，一些抗原的表达存在差异，这种情况应该用同一管中的混合抗体试剂进行检测。患者血浆或其他体液中存在高浓度的抗免疫球蛋白抗体，在用抗免疫球蛋白的试剂染色前，需用PBS充分洗涤去除残留的血浆或嗜细胞的免疫球蛋白[2]。
用于免疫分型的抗体选择原则应遵循：(1)抗原表达高的抗体偶联发射波长较短的荧光素，抗原低表达的抗体偶联波长较长的荧光素；(2)应用通用的、同样荧光色素标记的抗体；(3)保证在一个系列中准确分析细胞亚群和鉴别非特异抗体结合；(4)分化与成熟阶段相关抗原与谱系相关抗原组合。
常用的检测和鉴别急性白血病各系列的特异性标志为：T淋巴细胞白血病：胞浆抗原(c)CD3、抗T细胞受体(TCR)αβ、抗TCRγδ、CD2、CD5、CD8、CD10、CD1a和CD7；B淋巴细胞白血病：cCD79a、CD22、CD19、CD10和CD20；髓系白血病：抗髓过氧化物酶(MPO)、CD117、CD13、CD33、CD14、CD15和CD64；NK细胞白血病：CD16、CD56和CD57；红白血病：CD235a、CD36和CD71；巨核细胞白血病：CD41、CD42和CD61。
(1)表达B细胞相关抗原：分析末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)和cIgμ与B细胞系列组合中的CD10和CD20可决定免疫亚型。如果TdT和CD34均为阴性时，需分析是否为成熟B细胞疾病。(2)表达T细胞相关抗原：TdT、CD1a和cCD3分析与CD4、CD5、CD8和CD56同时应用以决定免疫亚型。如CD56高表达，可考虑母细胞性浆细胞样树状突细胞肿瘤。如果TdT和CD34均阴性时，需分析是否为成熟T细胞疾病。(3)表达髓系相关抗原：MPO可以帮助识别分化的AML亚型。HLA-DR和CD14可以识别区分髓单核细胞和单核细胞变异体。CD41、CD61、CD36和CD235a能进一步区分急性红白血病和原始巨核细胞白血病。(4)髓系相关抗原，B细胞和T细胞相关抗原均不表达：应补充检测CD41、CD61、CD36和CD235a，通过CD45用于区分急性未分化白血病(CD45＋CD41－CD61－CD36－CD235a－)和急性红白血病(CD45－CD41－CD61－CD36＋CD235a＋)以及急性巨核细胞白血病(CD45－CD41＋CD61＋CD36－CD235a－)。(5)同时表达髓系和B细胞相关抗原：需要MPO、cCD22和cCD79a分析初步明确其谱系来源。如果MPO阴性，也可用其他方法确定髓系来源(CD11c、CD14、CD64和溶菌酶等)。如果确诊为混合表型急性白血病，则归类为混合表型急性白血病(Mixed Phenotype Acute Leukemia，MPAL)-B/髓系。如果系列分析结果提示为表达髓系相关抗原的B淋巴细胞白血病/淋巴瘤，可进一步根据B细胞系列抗原进行免疫亚型分析。如果谱系分析结果提示为表达B细胞相关抗原的AML，则不需要再进一步的分析。但如果不表达CD45，建议补充检测CD41、CD61、CD36和CD235a以排除急性红白血病和原始巨核细胞白血病。(6)同时表达髓系和T细胞相关抗原：需首先确定髓系和T细胞系列抗原。如果确定是混合性急性白血病，则归类为MPAL-T/髓系。如果为表达髓系相关抗原的T淋巴细胞性白血病/淋巴瘤，则通过T细胞系列分析决定免疫亚型。如果诊断为表达T细胞相关抗原的AML，则HLA-DR和CD14与非特异性的酯酶细胞化学分析一起应用可识别髓单核细胞和单核细胞变异体。
急性白血病的FCM免疫分型依据谱系特异性抗体和相关抗体，并结合形态学、化学染色以及遗传学检测等综合判断。
白血病FCM免疫分型中，建议采用两轮检测的方案可最大程度的节省抗体，并能对不同类型白血病进行详细分期。推荐用CD45/SSC设门分析原始幼稚细胞。MPO是髓系特异标志，cCD3和cCD79a分别表达于早期T细胞和B细胞。
推荐急性白血病分型的抗体包括：初诊急性白血病首选基本抗体：CD45、CD10、CD19、CD34、CD13、CD33、CD7、CD117、HLA-DR、MPO、cCD3、cCD79a；细分推荐选择性抗体：B-ALL：CD20、CD22、CD38、κ/λ、cμ；T-ALL：CD4、CD8、CD3、CD5、CD2、CD1a、CD56、TdT、TCRαβ、TCRγδ；AML：CD15、CD11b、CD64、CD14、CD16、CD41、CD61、CD71、GPA、CD56。
急性白血病免疫分型检测报告应包括标本中幼稚细胞比例及描述幼稚细胞群的免疫表型(包括抗原的表达百分比和表达强度)，还应包括下列内容：(1)患者信息：姓名、性别、年龄，送检医生、病史、临床发现、治疗史(如果与结果相关)。初步诊断。如果可能，也应提供近期FCM检查和其他实验室检查结果。(2)标本信息：标本号、来源、类型、标本采集和接收时间。(3)标本制备和染色：简要描述细胞分离，细胞的得率和存活力，以及染色(包括抗体使用情况)。(4)检测结果：如果存在异常的克隆，应描述表型，包括细胞大小、颗粒性和免疫表型及表达强度。充分描述异常细胞分析所用的技术和异常细胞的表型特征。建议使用表格形式报告抗原表达比例和异常细胞数值，文字给予必要的解释，附有代表性的异常流式图谱，供医生参考并作为日后比较的依据。
完整的FCM免疫分型报告应包括患者信息、标本信息、标记抗体和染色方法、结果的解释等。
急性白血病免疫分型数据报告应该包括标本中幼稚细胞比例及描述幼稚细胞群的免疫表型。对存在异常克隆的抗原应该提及抗原的强度。建议给出相关数据的典型流式图谱以帮助临床医生诊治。
急性白血病经化疗获得缓解后或骨髓移植治疗后，体内有残留白血病细胞的状态，称为MRD，是白血病复发的根源。FCM进行MRD监测的灵敏度可达0.01%。FCM用于MRD监测的关键是通过检测白血病相关免疫表型(leukemia associated immunophenotype，LAIP)正确区分残留的白血病细胞和正常的造血干/祖细胞[32,33,34,35,36]。
FCM进行MRD监测的依据是检测白血病相关免疫表型：血细胞分化成熟过程中正常表达的抗原缺失或表达过度；淋系和髓系相关抗原共表达；不成熟和成熟抗原的非生理性共表达。
MRD监测指标的有效性取决于所检测的抗体组合是否能够使白血病细胞群在FCM双参数散点图上出现的位置明显区别于正常骨髓中单个核细胞所处的位置。因此能否进行MRD监测除与流式细胞仪性能和所用的抗体组合有关外，还取决于白血病细胞是否具有特异的LAIP。对于初诊为急性白血病的患者，可首先通过几组抗体组合筛选确定患者特异的LAIP，如果LAIP阴性，则该患者不能用FCM进行MRD监测，可考虑其他技术方法监测；如果能筛选到该患者特异的LAIP，则在治疗过程中可用筛选出有效的1组或几组抗体组合进行FCM的MRD监测。推荐用于ALL和AML MRD监测的常用抗体包括：(1)B-ALL MRD：通用抗体：CD19、CD10、CD34；白血病相关性抗体：TdT、CD22、CD38、CD45、CD13、CD33、CD15、CD58、CD66c、CD21、cμ。(2)T-ALL MRD：通用抗体：cCD3、CD5、CD34；白血病相关性抗体：cTdT、CD33、CD19、HLA-DR(其中CD33、CD19、HLA-DR联合应用，用于排除非T系细胞)。(3)AML MRD：通用抗体：CD45、CD34、CD117；白血病相关性抗体：CD13、CD33、 HLA-DR、CD7、CD15、CD56、CD14、CD38、CD64、CD11b、CD19。
应注意白血病细胞表达的抗原有可能会发生变化而导致MRD检测结果的假阴性与假阳性。B-ALL患者CD34与CD10表面抗原变化率较高。与B-ALL相比，T-ALL表面抗原变化较少。目前除利用FCM监测MRD外，实时荧光定量PCR技术可通过检测肿瘤特异序列包括白血病细胞特殊的抗原受体基因重排、染色体易位和融合基因来检测MRD，敏感度为10－4～10－6[37]。FCM结合PCR可互补应用，提高急性白血病MRD监测的灵敏度。
建议分两步监测MRD，首先对初发患者用四色或四色以上流式抗体组合进行MRD标志物的筛选，确定存在有效的监测指标后，在治疗过程中利用筛选出的有效抗体组合进行MRD监测。
并不是所有的白血病患者都可以进行MRD监测，利用四色抗体组合可对约90%的B-ALL进行监测，但仅能监测少部分AML。监测中应考虑白血病细胞抗原表达变化引起的假阴性等干扰因素。
建议B-ALL MRD采用CD19/SSC设门、T-ALL MRD采用CD3/SSC设门，AML采用CD45/SSC设门方案。FCM监测MRD的灵敏度约为0.01%，应尽量多收集有核细胞数，超过1.0×106为宜。
FCM检测DNA倍体的样本类型包括血液、各种浆膜腔积液和实体组织等。血液标本建议采用EDTA或肝素抗凝，浆膜腔积液标本量应足够。实体肿瘤组织采集后盛于细胞培养液中送检，组织块应尽量大。FCM制备实体瘤单细胞悬液的方法主要有机械法分散法和酶消化法，实际应用中应根据组织标本的特性选择一种或两种方法配合使用。全血和血性积液标本都需溶血后再检测[38]，同时采用正常人新鲜血液淋巴细胞作为对照。
商品化的DNA倍体分析试剂盒应用方便，可提高操作的规范性和结果的一致性。数据分析多采用各流式细胞仪配套的DNA分析软件。FCM分析某一细胞群的DNA含量，结果以DI表示，即与正常的二倍体细胞G0/G1期相比DNA含量的比值。正常细胞G0/G1期DNA含量为二倍体，DI值为1.0，除正常生精细胞DI为0.5，其他的DI非1.0(±0.05)的细胞称为异倍体。FCM检测DNA含量的改变，可作为癌前病变发展至恶性中的一个有价值的指标[39]。通过检测细胞周期变化，还可了解化疗药物对细胞循环周期的作用。应该注意的是，DNA含量的正常结果不能除外恶性或染色体异常的存在。
DNA倍体分析作为临床常规开展项目时，结果应结合临床分析并注意除外非肿瘤因素的影响。建议采用商品化的DNA倍体分析试剂以提高检测灵敏度和准确性。
FCM通过分析红细胞和白细胞等血细胞膜上的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)锚定蛋白异常或缺失表达，用于贫血的鉴别诊断、辅助PNH诊断，并能明确导致PNH的异常细胞类型、异常蛋白分子以及病变程度[40]。由于我国PNH发病率低，对有血红蛋白尿，贫血原因难以明确的患者如Coombs实验阴性、尤其是未见细胞形态异常，或无明显感染的溶血性贫血等患者考虑做PNH检测，以辅助诊断和鉴别诊断。如果患者只有贫血表现，而且引起贫血的其他原因排除后仍不能解释贫血原因时也可以检测PNH[40]。
FCM检测PNH首选EDTA抗凝外周血，也可选择肝素钠和枸橼酸钠抗凝，标本采集后24～48 h内进行检测。单纯检测红细胞表面的缺失蛋白并不能对PNH做出准确判断，需进一步检测白细胞。标记抗体建议用藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记CD55，异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记CD59。虽然CD55和CD59被广泛用于检测粒细胞上PNH克隆细胞，但有数据表明也可能无法检测PNH的微小克隆细胞[41,42]。目前检测白细胞GPI锚定蛋白缺失的最理想试剂是直接荧光标记的气单胞菌溶素(aerolysin or FLAER)。FLAER是与GPI锚定蛋白结合最特异的物质，在GPI锚定蛋白缺失的单核细胞和粒细胞上FLAER为阴性[43]。
分析红细胞上GPI锚蛋白缺失用FSC和SSC(Log取数)易于与血小板或碎片区分，获取5000～10 000个红细胞。检测粒细胞上GPI锚定蛋白缺失，用FSC/SSC或CD45/SSC设门。单核细胞较少时，加用CD14抗体标记以圈出单核细胞。分析外周血粒细胞时，建议使用系列标记(非GPI锚定蛋白)/SSC设门的方法[44]。
推荐使用免溶血法检测PNH，同时分析红细胞的CD55、CD59和粒细胞的FLAER用于PNH的诊断。分析外周血粒细胞时，建议使用系列标记(非GPI锚定蛋白)/SSC设门的方法。
FCM在红细胞检测中的应用包括网织红细胞计数、红细胞抗原抗体检测与定量、致敏红细胞等。
网织红细胞计数用以反映骨髓造血功能状态。FCM计数网织红细胞，采用荧光染料噻唑橙(TO)结合到RNA上后显示强荧光[45]。分析时，采用FSC-SSC设门，分析红细胞门内细胞的荧光表达情况。网织红细胞绝对含量＝网织红细胞(%)/ 100 (RBC 1012/L)。网织红细胞漂移的校正：网织红细胞校正值(%)＝患者血球压积/正常人血球压积均值×网织红细胞(%)。各实验室应建立各自的网织红细胞计数的正常值范围。
FCM也可检测抗体致敏红细胞。直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test，DAT)是溶血性贫血的常规检测方法，但灵敏度较低，影响因素多。FCM用于抗体致敏红细胞的检测，所需标本量很少，灵敏度高。FCM可用于检测自身免疫性疾病中红细胞的自身抗体，FCM也可检测红细胞结合的IgG亚型。
FCM检测网织红细胞时，应考虑漂移的校正，建议采用校正公式以保证检测结果的准确性。
FCM是血小板分析研究的最好手段，检测灵敏度高、人为干扰相对少[46,47]。
国际血液学标准化委员会(International Committee for Standardization in Haematology，ICSH)/国际实验血液学协会(International Society for Experimental Hematology，ISLH)和国家卫生部(WS/T244-2005)均推荐FCM作为血小板计数参考方法。用荧光素标记的CD41和CD61抗体标记血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物后流式细胞仪检测血小板，使用前向角散射光的log值(log FSC)和荧光信号的log双参数，进而从噪声、碎片和RBC中识别出血小板。应使用符合要求的塑料材质注射器或真空采血系统采集静脉血标本，采集后置于18～22 ℃室温条件下、取血后4 h之内完成检测。标本检测的整个过程中必须使用聚丙烯或聚苯乙烯容器。
血小板表面具有多种表面抗原，较常标记的包括CD41(GPⅡb)、CD42b(GPⅠbα)、CD61(GPⅢa)、CD62P、CD36(GPⅢb)、CD63(LIMP)等与血小板的黏附、聚集和活化功能相关的指标。对于检测活化血小板，标本的采集和运送是最关键的实验步骤。建议检测者最好在FCM检测室即时抽取，采血时用大号针管，弃用抽出的前2 ml血，采集后在10 min内开始处理，最长不应超过30 min；如需运送标本，送取过程中尽量避免标本受到物理振动。FCM分析血小板时，首选枸橼酸钠抗凝；EDTA可影响血小板聚集，不适用于血小板功能检测；肝素可引起血小板的激活，也不适用血小板分析[48]。检测血小板活化需限制血小板自身的或被激活的体外活化，通过抗激活药物或固定方法都可限制血小板活化。固定会破坏某抗原与单抗结合的位点，所以在检测中选用恰当的阴性对照。
FCM分析血小板时，除同型对照外，还需要设置多种对照，具体依检测目的而定。在多色分析时，同型对照应与其他抗体同时使用，以避免补偿造成的误差。血小板体外活化试验中，可以使用正常人活化标本作为阳性质控；使用正常人未活化标本作为阴性质控。血小板自身抗体检测时，可使用含有已知血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阳性质控；使用不含血小板抗体的血清与血小板孵育，作为阴性质控。血小板表面抗原缺失检测时，可使用正常人标本做阳性对照，抗体的同型对照做阴性对照。
由于血小板体积小，FSC和SSC应采用对数模式取数，并调整电压，使血小板与细胞碎片和红细胞可以区分。可采用血小板特异抗体CD41或CD61设门，找出血小板，避免杂质碎片的干扰。血小板的检测可以判断患者是否需要抗血栓药物治疗，也可以监测这些抗血栓药物的作用，避免毒副反应的发生[49,50]。
FCM可作为血小板计数的参考方法。血小板检测应选择柠檬酸钠抗凝，并应规范抽血流程。
FCM测定血小板活化功能时常用二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)作为激活剂。FCM分析时，FSC和SSC采用对数放大模式，应用血小板特异性标志如CD41、CD61等设门准确选定血小板。
编写组成员：尚红(中国医科大学附属第一医院)、孙芾(北京和睦家医院)、王建中(北京大学第一医院)、崔巍(中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院)、沈茜(第二军医大学附属长海医院)、李莉(上海交通大学附属第一人民医院)、王兰兰(四川大学华西医院)、李智(同济大学附属杨浦医院)、王蓓丽(复旦大学附属中山医院)
(沈立松 袁向亮 潘柏申 执笔)
